核酸免疫进展.ppt

核酸疫苗核酸疫苗 一、概一、概 述述 核酸疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗又称基因疫苗或DNADNA疫苗疫苗，，就是把外源基因克隆到真核质粒表达就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒基因直接载体上，然后将重组的质粒基因直接免疫机体免疫机体 ，使外源基因在活体内表，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应引发免疫反应 （一）概（一）概 念念（（二）二）DNADNA疫苗的构成：疫苗的构成： 1. 1. 抗原表达基因抗原表达基因 2. 2. 真核细胞启动子（如真核细胞启动子（如CMV I.ECMV I.E启动子）启动子） 3. Poly A 3. Poly A 终止序列（如来自终止序列（如来自SV40 SV40 或或 BGHBGH基因）基因） 4. 4. 原核细胞选择标志（如青霉素抗性基因）原核细胞选择标志（如青霉素抗性基因） 5. 5. 增强免疫原性的核苷酸序列（如非甲基增强免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化化CpGCpG二核苷二核苷) )  二、二、DNADNA疫苗载体疫苗载体1. 1. 裸裸DNADNA疫苗：质粒、疫苗：质粒、 MIDGEMIDGE载体载体2. 2. 病毒载体：病毒载体： 天花病毒、腺病毒天花病毒、腺病毒 3. 3. 细菌载体：减毒活菌苗和繁殖缺陷细菌，细菌载体：减毒活菌苗和繁殖缺陷细菌，如伤寒菌苗、肠炎沙门氏菌苗、志贺氏菌如伤寒菌苗、肠炎沙门氏菌苗、志贺氏菌苗、单核细胞增生李斯特菌苗和小肠炎耶苗、单核细胞增生李斯特菌苗和小肠炎耶尔森氏菌苗尔森氏菌苗4. 4. 微粒包裹载体：金颗粒微粒包裹载体：金颗粒(gold particle)(gold particle)、、脂质体脂质体( (liposomesliposomes) )、、聚丙交酯聚丙交酯- -聚乙交酯聚乙交酯（（PLGAPLGA）、）、藻酸盐微粒藻酸盐微粒(alginate)(alginate)、、和纳和纳米微粒米微粒( (nanoparticlesnanoparticles) )Various methods of gene deliveryVarious methods of gene delivery 三、三、DNADNA疫苗与常规疫苗的比较疫苗与常规疫苗的比较DNADNA疫苗疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗 灭活疫苗灭活疫苗/ /蛋白亚蛋白亚单位单位 抗原类型抗原类型内源性内源性内源性内源性外源性外源性APCAPC加工过程加工过程 蛋白酶体蛋白酶体蛋白酶体蛋白酶体溶酶体溶酶体体液免疫应答体液免疫应答B B细胞细胞＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋主要的主要的IgGIgG类别类别IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG1 IgG1 DNADNA疫苗与常规疫苗比较疫苗与常规疫苗比较DNADNA疫苗疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗 灭活疫苗灭活疫苗/ /蛋蛋白亚单位白亚单位 细胞免细胞免疫应答疫应答 CD4CD4＋＋＋＋＋＋＋＋ThTh＋＋/ /－－Th1Th1＋＋/ /－－Th1Th1CD8CD8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ －－抗原提呈抗原提呈Ⅰ/ⅡⅠ/ⅡⅠ/ⅡⅠ/ⅡⅡⅡ免疫记免疫记忆忆体液免疫体液免疫＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋细胞免疫细胞免疫＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋/ /－－参与细参与细胞因子胞因子IL-2, 4IL-2, 4，， IFN- IFN-γ, TNF-βγ, TNF-βIL-2,IFN-IL-2,IFN-γ,TNF-βγ,TNF-βIL-4IL-4，，5 5，，10,1310,13DNADNA疫苗与常规疫苗比较疫苗与常规疫苗比较( (续续1 1））DNADNA疫苗疫苗减毒活疫减毒活疫苗苗 灭活疫苗灭活疫苗/ /蛋白亚蛋白亚单位单位 效应机制效应机制 CTL CTL CTL CTL 中和反应中和反应激活补体激活补体ADCCADCC效应效应 制备制备易于构建、生产易于构建、生产＋＋＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋＋费用费用＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋运输运输/ /存储存储 ＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋＋＋＋安全性安全性＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋DNADNA疫苗与常规疫苗比较疫苗与常规疫苗比较( (续续2 2））核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势：：(1)(1)诱诱导导机机体体产产生生全全面面的的免免疫疫应应答答，，其其保保护护性性免免疫疫应应答答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；(2)(2)无无减减毒毒、、灭灭活活疫疫苗苗可可能能引引起起的的致致病病作作用用，，具具有有可可靠靠的安全性；的安全性；(3)(3)能能表表达达经经修修饰饰的的天天然然抗抗原原，，具具有有与与天天然然抗抗原原相相同同的的构象和抗原性；构象和抗原性；(4)(4)与亚单位疫苗共有的高产性；与亚单位疫苗共有的高产性；(5)(5)可可将将编编码码不不同同抗抗原原的的基基因因构构建建在在同同一一个个质质粒粒中中，，或或将将不不同同抗抗原原基基因因的的多多种种重重组组质质粒粒联联合合应应用用，，制制备备多多价价核酸疫苗；核酸疫苗；(6)(6)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；(7)(7)生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。

生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便 四、核酸疫苗诱导的免疫反应四、核酸疫苗诱导的免疫反应核酸疫苗诱导的全身免疫应答反应核酸疫苗诱导的全身免疫应答反应 关关于于核核酸酸疫疫苗苗诱诱导导全全身身免免疫疫应应答答反反应应的的机机制制目目前前了了解解的的还还不不十十分分清清楚楚，，但但其其诱诱导导过过程程可可大大致致分分为为以以下下几几个阶段：个阶段：①①疫苗的摄取、转运及表达；疫苗的摄取、转运及表达；②②抗原的加工和提呈；抗原的加工和提呈；③③淋巴细胞的活化；淋巴细胞的活化；④④免疫效应细胞和分子的作用免疫效应细胞和分子的作用 Immune mechanisms induced by inoculation Immune mechanisms induced by inoculation Immune mechanisms induced by inoculation Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNAwith naked DNAwith naked DNAwith naked DNADepiction of the mechanisms of generation of antigen-Depiction of the mechanisms of generation of antigen-specific specific humouralhumoural and cellular responses. and cellular responses.五、核酸疫苗的构建五、核酸疫苗的构建 1、、将将亚亚单单位位疫疫苗苗的的编编码码基基因因作作为为核核酸酸疫疫苗苗的的候候选选基基因。

因 2、、多多肽肽合合成成疫疫苗苗的的核核酸酸推推导导序序列列作作用用核核酸酸疫疫苗苗的的候候选选基因基因 3、从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及编码基因、从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及编码基因 3．．1 免疫筛选法免疫筛选法 3．．2 化学分解法化学分解法 候选基因的筛选原则候选基因的筛选原则Ligate PCR product into pTARGETTM VectorTransform TG1 cellsSelecte recombinant clones by ampicillinpstpstⅠ Ⅰ酶切鉴定酶切鉴定酶切鉴定酶切鉴定挑取挑取挑取挑取S S基因正向插入的重组质粒基因正向插入的重组质粒基因正向插入的重组质粒基因正向插入的重组质粒pTARGETpTARGET- -hanShanS测序测序测序测序重组质粒重组质粒pTARGETpTARGET- -hanShanS的构建的构建:引物引物引物引物1:1:CT ACT CT ACT ATGATG GCA ACT ATG GAG GAA GCA ACT ATG GAG GAA引物引物引物引物2:2:AC AC TAA TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTCTTA GAG TTT CAA AGG CTCPCR正向正向: 酶切成酶切成3674，，1870，，1470反向反向: 可酶切成可酶切成3674，，2600,740 可可可可 酶酶酶酶 切切切切 成成成成 5.65.6kbkb和和和和1.31.3kbkb左右两个片段左右两个片段左右两个片段左右两个片段EcoREcoRⅠⅠⅠⅠ酶切酶切酶切酶切琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳回收回收回收回收5.65.6kbkb左右的大片段左右的大片段左右的大片段左右的大片段对照空载体对照空载体pTARGET的构建：的构建：用连接酶连接用连接酶连接用连接酶连接用连接酶连接成成成成为为为为闭闭闭闭环环环环pTARGETpTARGET空空空空载载载载体体体体, ,作为对照载体备用。

作为对照载体备用作为对照载体备用作为对照载体备用培养培养培养培养Vero-E6Vero-E6细胞细胞细胞细胞MEMMEM培养基培养基培养基培养基(10%(10%FCS) FCS) 3737℃℃℃℃，，，，5%CO5%CO2 2细细细细胞胞胞胞长长长长至至至至对对对对数生长期数生长期数生长期数生长期电穿孔转染重组质粒电穿孔转染重组质粒电穿孔转染重组质粒电穿孔转染重组质粒转染后转染后转染后转染后7272h h，，，，收获细胞收获细胞收获细胞收获细胞检检检检测测测测核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的瞬瞬瞬瞬时时时时表表表表达达达达, ,荧荧荧荧光显微镜下观察并拍照光显微镜下观察并拍照光显微镜下观察并拍照光显微镜下观察并拍照间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法重组质粒重组质粒pTARGET-hanS体外瞬间表达体外瞬间表达:核蛋白的瞬时表达结果核蛋白的瞬时表达结果pcDNA3.1+SpcDNA3.1+S的酶切鉴定结果的酶切鉴定结果1．．pcDNA3.1+S pcDNA3.1+S 质粒（质粒（6.76.7kbkb））2 2．．pcDNA3.1+S pcDNA3.1+S pstpstⅠⅠ酶切酶切 （（5.05.0kbkb，，1.7kb1.7kb））3. 3. pcDNA3.1+S（（ISS））pstpstⅠⅠ酶切酶切作为作为作为作为DNADNA免疫的注射样品。

免疫的注射样品免疫的注射样品免疫的注射样品质粒的大量制备及纯化质粒的大量制备及纯化: :按按按按分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆手手手手册册册册所所所所述述述述方方方方法法法法提提提提纯纯纯纯质质质质粒粒粒粒pcDNA3.1+pcDNA3.1+和和和和 pcDNA3.1+SpcDNA3.1+S用灭菌的用灭菌的用灭菌的用灭菌的PBSPBS溶解溶解溶解溶解调整浓度至调整浓度至1.0mg/ml用分光光度计测定用分光光度计测定A260/A280比值以确定比值以确定核酸样品的纯度，核酸样品的纯度，A260确定样品的浓度确定样品的浓度 实验动物的实验动物的DNADNA免疫免疫6～～8W 龄的龄的BABC/c小鼠小鼠空白质粒空白质粒pcDNA3.1+重组质粒重组质粒pcDNA3.1+S免疫前先用盐酸布比卡因注射液预处理免疫前先用盐酸布比卡因注射液预处理3天后天后相同部位进行相同部位进行DNA接种接种加强免疫一次，共免疫加强免疫一次，共免疫3次间隔间隔2周周细胞因子的动态变化细胞因子的动态变化常规方法分离脾细胞，浓度常规方法分离脾细胞，浓度1×10724孔孔细细胞胞培培养养板板每每孔孔加加入入脾脾细细胞胞悬悬液液0.5ml，，NP10 l(同同时时设设空空白白对对照孔，照孔， ConA刺激孔刺激孔)均设均设3个复孔个复孔37℃℃、、5%CO2孵箱培养孵箱培养48小时后小时后收收集集脾脾细细胞胞上上清清液液，，贮贮于于-70℃℃，，统统一一用用ELISA kits 检测检测IL-4和和IFN- 分分分分别别别别于于于于免免免免疫疫疫疫后后后后5 5d, d, 10d, 10d, 17d, 17d, 35d,42d35d,42d每组处死每组处死3只小鼠只小鼠淋淋巴巴细细胞胞增增殖殖反反应应: :脾细胞取自初次免疫后脾细胞取自初次免疫后42d的免疫鼠的免疫鼠以以重重组组的的核核蛋蛋白白刺刺激激免疫小鼠的脾细胞免疫小鼠的脾细胞阴性对照孔和阳性对照孔阴性对照孔和阳性对照孔(ConA)用用MTT法法检检测测脾脾细细胞胞的的增增殖殖反应，计算刺激指数（反应，计算刺激指数（SI））常常规规方方法法分分离离脾脾细细胞胞,浓度调整至浓度调整至2×106免疫鼠血清的抗免疫鼠血清的抗NPNP抗体的测定抗体的测定: :免免免免 疫疫疫疫 前前前前 和和和和 免免免免 疫疫疫疫 后后后后 5 5d, d, 10d, 10d, 17d, 35d,42d17d, 35d,42d经尾静脉采血经尾静脉采血经尾静脉采血经尾静脉采血N=6/group以以以以被被被被检检检检标标标标本本本本复复复复孔孔孔孔（（（（3 3孔孔孔孔））））ODOD值值值值与与与与免免免免疫疫疫疫前前前前血血血血清清清清（（（（阴阴阴阴性性性性对对对对照照照照））））的比值的比值的比值的比值≥2.1≥2.1者为阳性。

者为阳性者为阳性者为阳性重重组组的的NP作作为为包包被被物物，，辣辣根根过过氧氧化物酶标记的羊抗鼠化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗为二抗ELISA法检测血清的抗法检测血清的抗NP抗体抗体血清抗血清抗NPNP抗体滴度的测定抗体滴度的测定: :将将将将初初初初次次次次免免免免疫疫疫疫后后后后4242天天天天的免疫鼠眼球取血的免疫鼠眼球取血的免疫鼠眼球取血的免疫鼠眼球取血N=6/group留留留留置置置置血血血血清清清清，，，，以以以以1010倍倍倍倍稀稀稀稀释释释释为起点为起点为起点为起点, ,再做系列稀释再做系列稀释再做系列稀释再做系列稀释ELISA法法检测血清抗体滴度检测血清抗体滴度检测血清抗体滴度检测血清抗体滴度六、核酸疫苗的优化六、核酸疫苗的优化1 1、免疫效果的优化、免疫效果的优化 选择高效表达载体选择高效表达载体添加添加DNADNA免疫激活序列免疫激活序列 2 2、免疫途径的优化、免疫途径的优化 肌肉注射（im） 基因枪导入 皮内(id)和皮下(sc)注射 黏膜表面接种 Effects of Effects of Effects of Effects of CpGCpGCpGCpG motifs on various cells motifs on various cells motifs on various cells motifs on various cellsGeneration Generation Generation Generation of Immunity of Immunity of Immunity of Immunity after after after after Inoculation Inoculation Inoculation Inoculation of DNA of DNA of DNA of DNA Plasmid Plasmid Plasmid Plasmid with with with with GpGGpGGpGGpG MotifsMotifsMotifsMotifs2 2、免疫途径的优化、免疫途径的优化 3 3、、基因佐剂基因佐剂的应用的应用 细胞因子类细胞因子类共刺激分子共刺激分子分子佐分子佐剂联合合 4 4、抗原蛋白的泛素化表达、抗原蛋白的泛素化表达IL-12IL-12、、IL-15IL-15、、IL-18IL-18及及IFN-γIFN-γ以增强以增强Th1Th1型细胞应答为主型细胞应答为主。

IL-4IL-4加强体液免疫加强体液免疫IL-2IL-2能同时加强体液免疫和细能同时加强体液免疫和细胞免疫胞免疫 集落刺激因子集落刺激因子5 5、与基因重组疫苗联合应用、与基因重组疫苗联合应用  细胞因子产生的动态变化细胞因子产生的动态变化细胞因子产生的动态变化细胞因子产生的动态变化免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应血清特异性抗体的检测结果血清特异性抗体的检测结果血清特异性抗体的检测结果血清特异性抗体的检测结果SB7免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应血清的抗血清的抗NPNP抗体的测定结果抗体的测定结果血清的抗血清的抗NPNP抗体的测定结果抗体的测定结果七、核酸疫苗的安全性问题七、核酸疫苗的安全性问题 ①①局部反应原性和全身毒性研究，即考虑局部反应原性和全身毒性研究，即考虑DNADNA疫苗是疫苗是否有免疫毒性作用，机体是否对疫苗编码的抗原产生否有免疫毒性作用，机体是否对疫苗编码的抗原产生耐受性，或是否导致自身免疫反应，还应对疫苗中污耐受性，或是否导致自身免疫反应，还应对疫苗中污染的细菌蛋白是否诱发抗体产生进行评估；染的细菌蛋白是否诱发抗体产生进行评估；②②遗传性作用，即质粒遗传性作用，即质粒DNADNA是否与宿主基因组的整合是否与宿主基因组的整合问题；问题；③③生殖毒性研究，可采用生殖毒性研究，可采用PCRPCR方法对经质粒方法对经质粒DNADNA疫苗免疫苗免疫的雄性或雌性动物的性腺疫的雄性或雌性动物的性腺DNADNA提取物进行检测提取物进行检测④④致肿瘤性研究，如果质粒致肿瘤性研究，如果质粒DNADNA疫苗构建具有与人的疫苗构建具有与人的基因组同源的基因组同源的DNADNA序列，或其载体含有已知的潜在致序列，或其载体含有已知的潜在致癌基因序列时，需展开这方面的研究。

癌基因序列时，需展开这方面的研究 1 1、有关基因整合的研究、有关基因整合的研究 一个最重要的理论危机是质粒一个最重要的理论危机是质粒DNADNA与宿主与宿主基因组整合的问题，因为当外源基因组整合的问题，因为当外源DNADNA与基因组与基因组整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色体断裂，或染色体重排而致染色体不稳定，色体断裂，或染色体重排而致染色体不稳定，从而导致肿瘤细胞形成从而导致肿瘤细胞形成  尚尚无无证证据据证证明明以以自自身身表表达达质质粒粒的的形形式式存存在在于于染色体外的外源染色体外的外源DNADNA能整合入宿主染色体中能整合入宿主染色体中 其其整整合合发生生率率较自自然然整整合合发生生率率低低3 3个个数数量量级，，另另鲑鱼精精DNADNA已已经以以一一种种非非处方方药形形式式经口口服服或或注注射射等等多多种种方方式式使使用用了了数数十十年年，，却却未未见任何明任何明显的副作用的副作用 一些事实已清楚地证明脾内或口服裸一些事实已清楚地证明脾内或口服裸DNADNA可能导致整合可能导致整合 2 2、关于免疫耐受的研究、关于免疫耐受的研究 外外源源性性抗抗原原的的持持续续表表达达可可能能产产生生不不良良后后果果：：耐受性、自动免疫、过敏反应、超免反应等。

耐受性、自动免疫、过敏反应、超免反应等 持续低表达持续低表达------可被抗体中和清除，可被抗体中和清除， 无足够的免疫应答无足够的免疫应答 持续高表达持续高表达------超免反应发生超免反应发生——免疫抑制免疫抑制 — —其它病原感染其它病原感染 • 免疫免疫2 2天的小鼠产生耐受天的小鼠产生耐受• 免免疫疫出出生生2424小小时时内内的的小小鼠鼠，，与与在在成成年年小小鼠鼠中观察到的没有区别中观察到的没有区别 • HBsAgHBsAg转转基基因因小小鼠鼠进进行行DNADNA免免疫疫，，使使已已经经建建立立的的对对HBsAgHBsAg的的特特异异性性免免疫疫耐耐受受状状态态被被打打破破，，使小鼠产生抗使小鼠产生抗HBsAgHBsAg的特异性抗体的特异性抗体 实验结果实验结果：：结论结论：免疫耐受与抗原类型、浓度、给药：免疫耐受与抗原类型、浓度、给药方式及宿主种属、宿主年龄等因素有关方式及宿主种属、宿主年龄等因素有关 3 3、关于自身免疫性疾病的研究、关于自身免疫性疾病的研究 • 潜在性诱导抗质粒潜在性诱导抗质粒DNADNA的免疫反应是另一个必须关注的安全的免疫反应是另一个必须关注的安全性问题。

性问题研究表明：研究表明：• 用细菌用细菌DNADNA与与mBASmBAS及及CFACFA形成的复合体免疫小鼠，能形成的复合体免疫小鼠，能诱导小鼠产生与哺乳动物诱导小鼠产生与哺乳动物dsDNAdsDNA发生反应的发生反应的IgGIgG自身抗自身抗体• 用各种构建的质粒载体进行的质粒用各种构建的质粒载体进行的质粒DNADNA的免疫并未的免疫并未发现抗发现抗DNADNA抗体的产生抗体的产生• DNADNA疫苗接种有自身免疫倾向的小鼠，重复给药并疫苗接种有自身免疫倾向的小鼠，重复给药并没有启动或加重具有狼疮倾向个体的疾病发生及发展没有启动或加重具有狼疮倾向个体的疾病发生及发展过程  4 4、其它不良反应、其它不良反应 进进行行的的ⅠⅠ期期临临床床试试验验表表明明，，未未观观察察到不可接受的不良反应到不可接受的不良反应  八、八、DNADNA疫苗的应用疫苗的应用 （一）感染性疾病（一）感染性疾病 （二）肿瘤（二）肿瘤 （三）自身免疫病与变态反应（三）自身免疫病与变态反应表表 病毒的病毒的DNADNA疫苗疫苗病毒抗原免疫途径动物模型流感病毒HIV-1，2SIVFIVHTLV-1HBVHCVHEV狂犬病毒NP，HAenv混合，env，gag混合，envenv，rexHBsAg，envC，E2ORF3 GP肌注，基因枪，皮下，静注，in.肌注，基因枪，静注，鼻内，阴道内肌注，基因枪，静注肌注肌注肌注，皮下肌注肌注，基因枪，皮下小鼠、鸡、猪、雪貂小鼠、恒河猴、猿猴、人恒河猴大鼠兔小鼠、猿猴小鼠小鼠小鼠、猴病毒抗原免疫途径动物模型伪狂犬病毒登革热病毒麻疹病毒脑心肌炎LCMV轮状病毒猿猴病毒40牛疱疹病毒柯萨奇病毒埃博拉病毒HSV-1，2细小病毒CRPVRSVIE180,gD,gCpreM＋envHA,NPVP1NPVP6,VP4,VP7T-AggDVP1，混合NP,GPgB,ICP27，gD2VP1L1F肌注，基因枪基因枪肌注肌注肌注，皮下，基因枪，口服肌注肌注，皮下肌注基因枪肌注，眼内肌注肌注肌注，皮内小鼠，猪小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠牛小鼠小鼠，豚鼠小鼠，豚鼠狗兔小鼠表表 病毒的病毒的DNADNA疫苗（续）疫苗（续）表表 细菌的细菌的DNADNA疫苗疫苗细菌细菌抗原抗原接种途径接种途径动物模型动物模型结核分枝杆菌结核分枝杆菌伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体破伤风杆菌破伤风杆菌肺炎支原体肺炎支原体沙眼衣原体沙眼衣原体伤寒沙门菌伤寒沙门菌Hsp65Hsp65，，Ag85A,B,CAg85A,B,C19kDa.AhpC19kDa.AhpCOspAOspA破伤风毒素破伤风毒素ELIELIMOMPMOMP，，CTPCTPOmpCOmpC肌注肌注肌注肌注, ,皮下皮下肌注肌注肌注肌注小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠表表 寄生虫的寄生虫的DNADNA疫苗疫苗寄生虫寄生虫抗原抗原接种接种途径途径动物动物模型模型考德里体考德里体硕大利什曼原虫硕大利什曼原虫锥虫锥虫约氏疟原虫约氏疟原虫夏氏疟原虫夏氏疟原虫日本血吸虫日本血吸虫 MAP1MAP1gp63gp63trans-trans-sialidasesialidase，，ELIELICSP,PyHEP17,PySSP2CSP,PyHEP17,PySSP2CSPCSP肌注肌注皮下皮下肌注肌注肌注肌注肌注肌注小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠肿瘤抗原可被归为四类：肿瘤抗原可被归为四类：⑴ ⑴ 个体肿瘤具有的独特抗原个体肿瘤具有的独特抗原⑵ ⑵ 组织学相近肿瘤细胞具有的共同的抗原组织学相近肿瘤细胞具有的共同的抗原⑶ ⑶ 组织分化抗原组织分化抗原⑷ ⑷ 正常细胞和肿瘤细胞均表达的抗原正常细胞和肿瘤细胞均表达的抗原  DNADNA疫苗应用于肿瘤疫苗应用于肿瘤 DNADNA疫苗疫苗 肿瘤肿瘤 B B细胞独特型细胞独特型 淋巴瘤淋巴瘤 Gp75/Gp75/酪氨酸相关蛋白－酪氨酸相关蛋白－1 1 黑色素瘤黑色素瘤 MAGE,MART MAGE,MART 黑色素瘤黑色素瘤 前列腺表面抗原前列腺表面抗原 前列腺癌前列腺癌 突变突变P53P53基因基因 P53P53基因突变引起的基因突变引起的 肿瘤肿瘤 传统免疫方法用于变态反应性疾病治疗的传统免疫方法用于变态反应性疾病治疗的特点特点: :u重复注射、剂量逐渐增加重复注射、剂量逐渐增加u诱导诱导IgGIgG型封闭抗体型封闭抗体u引起变态反应的危险引起变态反应的危险u疗效不稳定疗效不稳定u费用高、时间长费用高、时间长u被药替代被药替代DNADNA疫苗用于变态反应性疾病治疗的特点：疫苗用于变态反应性疾病治疗的特点： u主要诱导主要诱导IgG2aIgG2a抗体抗体 u可中和变应原可中和变应原 u诱导较强的诱导较强的Th1Th1应答应答 u抑制抗原特异性抑制抗原特异性IgEIgE合成合成 u和嗜酸性粒细胞的活化和嗜酸性粒细胞的活化 u不会引起变态反应不会引起变态反应 u抑制炎症反应抑制炎症反应自身免疫病自身免疫病( (多发性硬肿症、类风湿性关节炎、多发性硬肿症、类风湿性关节炎、ⅠⅠ型糖尿病型糖尿病) )对微生物对微生物对微生物对微生物应答降低应答降低应答降低应答降低针对自身组针对自身组针对自身组针对自身组织织织织T T T T细胞活化细胞活化细胞活化细胞活化抗前炎症介质抗前炎症介质抗前炎症介质抗前炎症介质抗体（少量抗体（少量抗体（少量抗体（少量) ) ) )前炎症介质（细胞前炎症介质（细胞前炎症介质（细胞前炎症介质（细胞因子、趋化因子）因子、趋化因子）因子、趋化因子）因子、趋化因子）产生量增加产生量增加产生量增加产生量增加炎症，组织损伤炎症，组织损伤炎症，组织损伤炎症，组织损伤中和效应中和效应中和效应中和效应炎症反应、组织损伤减轻炎症反应、组织损伤减轻炎症反应、组织损伤减轻炎症反应、组织损伤减轻DNADNADNADNA疫苗疫苗疫苗疫苗有待进一步研究的问题：有待进一步研究的问题： ◆◆ DNADNA疫苗目的基因的选择疫苗目的基因的选择 ◆◆ 目的基因的高效表达目的基因的高效表达 ◆◆ 优良载体的构建优良载体的构建 ◆◆ 诱导适当免疫应答（诱导适当免疫应答（个体中差异个体中差异）） ◆ ◆ 安全性安全性 ◆ ◆ 改善改善制备和纯化工艺制备和纯化工艺核酸疫苗是一个新生事物核酸疫苗是一个新生事物：： 核酸疫苗是综合分子生物学、核酸疫苗是综合分子生物学、细胞生物学、免疫学等前沿领域细胞生物学、免疫学等前沿领域的新兴技术。

其研究方向符合儿的新兴技术其研究方向符合儿童计划免疫童计划免疫“一种疫苗预防多种一种疫苗预防多种疾病疾病”的目标，具有广泛的应用的目标，具有广泛的应用前景。