plla纳米纤维编织缝合线的制备及生物相容性研究.pdf

PLLA纳米纤维编织缝合线的制备及生物相容性研究3胡 雯1,黄争鸣2,唐 亮3(1.同济大学 材料科学与工程学院,上海200092 ;2.同济大学 航空航天与力学院,上海200092 ; 3.同济大学 附属上海肺科医院中心实验室 上海200433)摘 要: 以PLLA为原料,采用静电纺丝和圆盘定 向收集得到具有有序排列的纳米纤维束,并将其编织 成线,得到PLLA纳米纤维缝合线对新型可吸收 PLLA缝线的微观形貌、 血液相容性、 细胞毒性进行了 性能表征,并测试了其力学性能结果表明,纳米纤维 在一定的圆盘转速下表现出较好的定向性,力学性能 良好缝线在溶血试验中溶血率 99. 5 % ,MTT购自Solarbio公司,DMEM培养液 (Invitrogen Corporation ,10 %小牛血清) ,二甲亚砜 (DMSO)购自国药集团上海分公司;96孔细胞培养板 (Greinerbio2one ,German) ,756MC型紫外分光光度仪 (上海第三分析仪器厂) ,Wellscan M K3型酶联免疫检 测仪(Labsystems Dragon公司) ,BX51型光学显微镜 (OL YMPUS ,Japan) ,CKX412A32PH型荧光倒置显 微镜(OL YMPUS , Japan) ,STS22型脱色摇床(上海琪 特分析仪器有限公司) ,MCO2175型CO2培养箱(日本 三洋)。

2. 2 方 法 2. 2. 1 电纺溶液配制 将一定质量的PLLA加入到TFE中,超声波振荡 0. 5～1. 5h ,获得透明、 稳定的溶液配置浓度为8 % (质量分数)的纺丝液2. 2. 2 电纺纤维束的制备 电纺喷头采用19G注射针头(内径0. 65mm ,外径 1. 1mm) ,采用BGG直流电压发生器(北京市机电研 究院)产生高压直流电,WZ250C2型微量注射泵(浙江 大学医学仪器有限公司)供液,喷丝系统自行研制采 用快速旋转的尖角圆盘(见图1) ,用于纤维的定向收 集,收集时间(4±0. 5) min装置离喷丝口距离为13 ～15cm ,电纺的环境温度为(25±2)℃,环境湿度为 60 %±5 % 2. 2. 3 纤维束后处理 将收集下来的PLLA纳米纤维束置于80℃下进 行热处理30s后在自制的拉伸装置上拉伸,拉伸倍率 设置为70 % ,将经拉伸处理后的纤维束在自制的加捻88812009年第11期(40)卷3基金项目:国家自然科学基金资助项目(50773054) 收到初稿日期:2009203223收到修改稿日期:2009206229 通讯作者:黄争鸣 作者简介:胡 雯 (1981 - ) ,女,安徽铜陵人,在读博士,师承黄争鸣教授,从事纳米纤维材料研究。

装置上加捻处理,随后保持张力紧张热定型,热定型温 度为80℃,热定型时间2h图1 尖角圆盘装置示意图 Fig 1 Schematic drawing of rotating disc 2. 2. 4 编 织 选取8锭经后处理的PLLA纳米纤维束,采用X 系列编织机(购自上海香海织带机械有限公司)进行编 织,得到结构紧凑、 直径均一的编织线(图2)图2 PLLA编织线的形貌图Fig 2 A braided PLLA wire2. 2. 5 溶血试验 取ACD抗凝全血8ml ,加10ml生理盐水稀释备 用截取PLLA编织缝线1g放入小试管内,用蒸馏水 冲洗3次,再用生理盐水冲洗3次加入0. 2ml的稀 释血液和10ml生理盐水,在水浴中恒温60min其中 阳性对照和阴性对照分别用10ml蒸馏水和10ml生理 盐水各加0. 2ml的稀释血,与样品同样操作随即以1000r/ min离心5min ,取上清液,用721型分光光度 计在545nm处测吸光度溶血率(HR)按下式计算:HR =AS-AN AP-AN×100 %(1)其中AS为ACD全血与样品接触后与545nm处 的相对吸光度;AP、AN分别为阳性对照物、 阴性对照 物在545nm处的相对吸光度。

评价标准:若溶血率5 % ,可判断该材料具有溶血作用2. 2. 6 细胞毒性试验 采用MTT法测定材料浸提液的细胞毒性 (1) 浸提液制备:将制成的缝线置蒸馏水中超声波清洗5min ;高压蒸汽灭菌(120±1)℃,20min分别取1g试样,加入5ml DMEM培养液中,置37℃培养 箱中48h即成材料浸提液分别配制成100 %、75 %、 50 %、25 %浓度的材料浸提液 (2) MTT法测定:将人脐静脉内皮细胞( HU2 VEC)以0. 25 %胰酶消化,10 %FCS2DMEM培养基调 整细胞密度为5×104/ ml以5×103/ 100μl/孔加入 96孔平地细胞板,12h ,在5 %CO2浓度、37℃ 的培养箱 中,过夜贴壁弃去上清液,每孔加入100 %、75 %、 50 %、25 %的浸出液,每种浓度各4个重复,并设0. 1 % 苯酚孔为全致死对照孔(阳性对照组)96孔板以 200μl/孔加入5mg/ ml的MTT溶液,于5 %CO2、37℃ 继续培养4h ,弃上清后以200μl二甲亚砜(DMSO)溶 解30s后在570nm酶标仪上比色分别于1、3、5、7d 后,取96孔板各一块采用MTT法,测定细胞活率;根 据各组A值按照下述公式分别计算MTT吸光度均 值,与阴性对照孔(生理盐水)比值为各实验组细胞相 对增殖率(RGR) :RGR =浸提液组平均A值 阴性对照组平均A值×100 %(2)其中材料的毒性用6级毒性分级法来评价:≥ 100 %为0级,75 %～99 %为1级,50 %～74 %为2级, 30 %～49 %为3级,15 %～29 %为4级,0～14 %为5 级。

2. 2. 7 细胞形态与生长情况 取上述经实验材料浸提液培养的人皮静脉内皮细 胞,每隔48h用倒置显微镜(×200)观察细胞形态及生 长情况 2. 2. 8 性能表征 采用HITACHI S22360N型扫描电镜(SEM)观察 纳米纤维束的表面形貌,加速电压20kV应用图像分 析软件Image J对SEM照片进行分析,随机抽取50 根纤维的直径,根据所得数据计算纤维直径的平均值 裁剪1cm的纳米纤维线,固定在光学显微镜(U2 nion D23高变焦比视频显微镜)下观察,放大250倍 用设备所带的Avercap图像处理软件捕捉图像,以标 尺为参考采用Image J软件确定直径 力学性能表征参照ASTMD2256202标准[12],采 用CSS244020型(长春试验机厂)力学测试仪测试纳米 纤维线的拉伸力学性能试样长度取130～150mm的 线段,试验时采用定制的10N微型加载池,横梁移动 速度为10mm/ min3 结果与讨论3. 1 静电纺PLLA纳米纤维的微观形貌 本实验采用快速旋转的尖角圆盘收集装置,能得 到一定方向性、 一定长度和直径的线状纤维束当圆 盘转速为1205r/ min ,纤维表现出较好的定向性[11]。

由图3可以看出8 %(质量分数)浓度的PLLA电纺纳 米纤维体现出较好的形貌,纤维光滑均一、 没有珠状物9881胡 雯 等:PLLA纳米纤维编织缝合线的制备及生物相容性研究或纤维粘并现象出现根据Image J图像分析软件测 量出PLLA纳米纤维的直径分布在238～965nm ,平 均直径为667nm图3 定向排列的纳米纤维 Fig 3 Uniaxially aligned nanofibers 3. 2 PLLA编织缝线的形貌和力学性能测试 图2是PLLA纳米纤维束经编织后的形貌图,由 图2可以看出,编织线结构紧密、 表面平滑、 均匀拉 伸力学强度和打结强度是缝合线的重要性能,图4比 较了PLLA纳米编织缝合线在直接拉伸和打结拉伸 时的应力-应变曲线可以看出,曲线均可分为弹性 段和塑性段两个部分,缝线无论是直接拉伸还是打结 拉伸体现出相近的力学性能,PLLA缝线直接拉伸强 度为(89. 5±3. 5) MPa ,而打结强度为(86. 7±2. 8) MPa ,断裂伸长率也不相上下,分别为(87. 1±4. 6) % 和(93. 0±5. 2) %说明PLLA纳米编织缝线直接拉 伸和打结拉伸都体现出较好的力学性能。

图4 PLLA缝线及其打结缝线的拉伸应力2应变曲线Fig 4 Tensile stress2strain curve of PLLA and itsknot suture3. 3 材料溶血实验 根据国家GB/ T 16886. 422003标准,缝合线属于 植入性材料,ISO要求应用于机体并与生物组织直接 接触的生物医用材料都需要进行溶血测试[13]其原 理是通过对材料和血红细胞在体外接触过程中所导致 的红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定来评价材料 的血液相容性当溶血试验测得有溶血活动时,则材 料有毒性[14]该项试验能敏感的反应试样对红细胞 的影响,是一种特别有意义的材料筛选试验本实验 中PLLA缝线组和生理盐水阴性对照组均无溶血现 象,而阳性对照组全部溶血计算结果见表1 ,实验组 的溶血率为4. 75 % ,符合ISO规定的不大于5 %的标准,满足医用生物材料的要求 表1 OD数值表(x±SD) Table 1 OD measurement dataPLLA缝线组 (AS)阴性对照组 (AN)阳性对照组 (AP)OD值0. 0420±0. 00560. 0060±0. 0007 0. 7640±0. 0352 溶血率 ( %)4. 7501003. 4 细胞毒性试验 四唑盐比色MTT法能非常灵敏的反映出受试材 料对细胞造成的毒性损害。

采用间接接触法,将材料 浸提液对细胞生长产生的影响经MTT法显色,然后 通过检测其A值差异来判定细胞的生长、 增殖状况, 从而反映材料对细胞的毒性程度[15]该方法具有简 便快捷、 敏感直观、 重复性好等优点[16]MTT检测能 快速对材料的细胞毒性做出可靠的定量评定,细胞毒 性通常随溶出物浓度的增高而增大,本实验应用不同 浓度(100 %、75 %、50 %、25 %)的浸提液对分别浸提 1、3、5、7d以便使细胞毒性显现实验结果表明PL2 LA缝线材料对HUVEC细胞的增殖没有影响,RGR > 85 % ,细胞毒性 ≤1级,表明受试材料无细胞毒性 各时间点细胞数实验组均高于阳性对照组,细胞数量 随培养时间的延长逐渐增多,说明该缝线对HUVEC 细胞的增殖有促进作用,对细胞的生长增殖表现出良 好的细胞相容性 3. 5 细胞形态及生长情况 实验组和阴、 阳性对照组在5 %浓度CO2培养箱 中,于37℃ 培养7d ,每48h用倒置显微镜观察细胞形 态及生长情况并拍照如图5所示(a、b、c、d分别为 PLLA缝线组浸提液与细胞接触培养后1、3、5、7d的 细胞形态(×200) ,e图为阳性对照组细胞形态(× 200))。

显微镜下观察发现:材料组浸提液与细胞接触 培养1d后,部分细胞呈圆形贴壁3d时,细胞生长旺 盛,贴壁生长良好,细胞形态呈梭形和不规则多角形, 未见明显圆缩,部分细胞呈簇状分布,中间出现小的细 胞集落,细胞界限不清,多层堆积5d后细胞数量迅 速增多,细胞直径增大,主要为梭形和多角形细胞,突 起于瓶壁上,随时间延长细胞数量逐渐增多,7d时,未 见细胞形态发生改变,呈梭形或多角形,细胞生长旺 盛,排列紧密,而阳性对照组的基本未见活细胞,细胞 变圆,细胞核浓缩,核仁圆,镜下可见漂浮的死细胞,基 本不贴壁,见表209812009年第11期(40)卷图5 倒置显微镜下细胞HUVEC细胞形态 Fig 5 Cellular morphology of HUVEC observed by inverted microscope 表2 细胞增殖率、 细胞毒性实验结果 Table 2 Material t。