醋酸纤维薄膜.ppt

实验二,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,一、实验目的,学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 了解电泳技术的一般原理,二、实验原理,任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动 如氨基酸、蛋白质、酶、核酸等及其衍生物质都具有许多可解离的酸性或碱性基团，它们在溶液中会解离而带电一般在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动移动的速度取决于带电的多少和分子的大小泳动度,不同质点在同一电场中的泳动速度不同，常用泳动度或迁移率来表示泳动度指带电质点在单位电场强度下的泳动速度 v d/t dl u = = = （ cm2.V-1.S-1) E V/l Vt,影响泳动度因素,带电质点的性质 质点所带净电荷的量、质点的大小及质点的形状一般说来质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快；反之则越慢溶液的粘度 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 固体支持物的电渗现象,本实验用醋酸纤维薄膜，是纤维素的羟基乙酸化所形成的纤维纤维素醋酸酯。

具有泡沫状的结构，厚度均为120um，有很强的渗透性，对分子移动阻力很小三、器材与试剂,醋酸纤维薄膜 2*8cm 常压电泳仪 点样器：用盖玻片代替 培养皿 玻璃板 粗滤纸 电泳槽 巴比妥缓冲液：pH8.6，离子强度0.07 巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g，加水至1000ml 每个大组500ml,染色液 每个大组200ml 氨基黑10B0.25g,甲醇50ml,冰醋酸10ml,水40ml（可重复使用） 漂洗液 每个组100ml 含甲醇或乙醇45ml、冰醋酸5ml、水50ml 透明液 每个组200ml 含无水乙醇：冰醋酸7：3，本实验不做定 量不用配四、操作方法,1、薄膜准备：用镊子取醋酸薄膜一张，放在绥冲液中浸泡20分钟识别光泽面与无光泽面，并在有光泽面一角做记号） 2、制造滤纸桥：剪取双层合适尺寸滤纸桥附在电泳槽支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中，用缓冲液润湿并驱赶气泡，使滤纸紧贴在支架上如图,,,3、点样：取出膜条，用双层滤纸吸干多余的液体，平铺在玻璃板上，无光泽面朝上，用点样器蘸取血清在膜条的一端1.5cm处，均匀划一条线 4、电泳：在两电极槽内加入等高的缓冲液，将膜条平悬于滤纸桥上（点样端靠近负极），盖严电泳室通电，电压120V，电流0.4-0.7mA/cm 膜宽，电泳60分钟。

5、染色：电泳完毕后，取膜条放在染色液中浸泡10分钟左右 6、漂洗：漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的图谱 7、透明：将干燥的电泳图谱放入透明液中浸泡2-3分钟后取出贴于洁净的玻璃板上，干后放在两层滤纸中保存 8、计算：计算出每条蛋白的泳动度注意事项,手尽量不要接触膜条 用点样器点样时不要点的太多，但也不 能太少线条均匀，用力水平 电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液五、实验结果,六、结论与分析,思考题,1、用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点？ 2、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确的操作？ 3、为什么要将点样一端放在电泳槽负极? 4、 根据人血清中蛋白各组分的等电点，估计它们在pH8.6的巴比妥电极缓冲液中电泳移动的相对位置。