菌种的传代保藏.ppt

菌种的传代、保藏菌种的传代、保藏 及菌液制备及菌液制备 标准菌种的概念及其管理标准菌种的概念及其管理§标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种§我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCMCCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCCCMCC）提供菌种的名称菌种的名称§铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］§生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］§大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］§金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］§沙门菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］沙门菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］§枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］§白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］§黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］微生物菌种的使用、保存与管理、验证。

微生物菌种的使用、保存与管理、验证§一.制定菌种使用保藏管理程序§（1）做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚.§（2）菌种的接收与复活标准菌种的保藏形式    我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态培养基的选择培养基的选择§细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代§真菌一般用改良马丁培养基菌种的传代菌种的传代§菌种的复苏§菌种的确认§菌种的接种§菌种的保藏菌种的复苏菌种的复苏§《中国药典》2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代§从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种严格控制菌种的传代严格控制菌种的传代§避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作§1.1.复溶菌种并转种复溶菌种并转种     按菌种说明书要求复溶所转按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）§2.2.鉴定菌种后制甘油冷冻管鉴定菌种后制甘油冷冻管     经菌种特性鉴定后，经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管   ，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代）工作用菌种（为第三代）§3.3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验试验§4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）§5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。

§6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接§转接第四代，直至四代转为五代菌种菌种保藏标签的规范与要求§菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录严格菌种的质量控制，确保菌种的质量严格菌种的质量控制，确保菌种的质量§菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验菌种处理的注意事项与有关记录菌种处理的注意事项与有关记录§菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。

其他标准品的特殊要求§1.1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严密安全的保藏管理的危害程度，要实行严密安全的保藏管理§2.2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等§3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安全防护措施规程，采取有效预防措施进行自我保护§4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决§5相关记录  在菌种的使用制备与保藏过程中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式菌种的确认菌种的确认一.初步鉴定试验§分离培养—菌落形态§革兰染色—菌体染色特性及菌形§生化试验—检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类二二.全面鉴定全面鉴定§血清分型血清分型§毒素分析毒素分析——内毒素和外毒素内毒素和外毒素§基因分型基因分型§蛋白组分析蛋白组分析§自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌§形态特征：形态特征：GG- -杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无芽胞、有荚膜、单端有芽胞、有荚膜、单端有1 1～～3 3根鞭毛。

根鞭毛§培养特性：专性需氧，最适温度为培养特性：专性需氧，最适温度为3535℃℃，但在，但在42 42 ℃℃生生长是铜绿假单胞菌的一个特点营养无特殊要求，普通长是铜绿假单胞菌的一个特点营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜§分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基§生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）紫红色）　　　　　　绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）　　　　　　　　　　　绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）　　　　　铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态琼脂平板的形态铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌—鞭毛染色形态鞭毛染色形态生孢梭菌生孢梭菌§ §形态特征：形态特征： G G＋＋粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体革兰染色为阴性革兰染色为阴性   ，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。

位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动§ §培养特性：专性厌氧，但要求不严格一般培养时不易培养特性：专性厌氧，但要求不严格一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落在形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光滑、湿润、不透明的菌落在硫乙醇酸盐流体培养基光滑、湿润、不透明的菌落在硫乙醇酸盐流体培养基中常在其表面形成菌膜中常在其表面形成菌膜大肠埃希菌大肠埃希菌§ §形态特征：形态特征： G G- -直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运动§ §培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长§ §分离培养：伊红美兰培养基（分离培养：伊红美兰培养基（EMBEMB平板）平板）§ §生化反应：生化反应：IMViCIMViC试验结果：＋＋－－试验结果：＋＋－－                     MUG                      MUG 试验结果：荧光：＋试验结果：荧光：＋                                                                                                            大肠埃希菌大肠埃希菌—EMB平板菌落形态平板菌落形态大肠埃希菌大肠埃希菌—显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态大肠埃希菌大肠埃希菌—电镜下菌体形态电镜下菌体形态金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌§形态特征：形态特征： G G＋＋球菌、呈单个、成双、短链或排球菌、呈单个、成双、短链或排列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。

列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞§培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落菌落因种不同隆起、边缘整齐、不透明的菌落菌落因种不同而出现不同的色素在营养肉汤培养基中呈均匀而出现不同的色素在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长混浊生长§分离培养：高盐甘露醇培养基分离培养：高盐甘露醇培养基§生化反应：生化反应：血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验结果：＋结果：＋                                                金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌—显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌—电镜下菌体形电镜下菌体形态态沙门菌沙门菌§形态特征：形态特征： G G- -直直   杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有周身鞭毛，能运动周身鞭毛，能运动§培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落。

在营养肉汤培养基中半透明、边缘整齐的菌落在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长呈均匀混浊生长§分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)(S.S)琼脂培养琼脂培养基基§生化反应：生化反应：三糖铁琼脂反应：碱三糖铁琼脂反应：碱/ /酸，葡萄糖产酸，葡萄糖产 气，气，H H2 2S S阳性阳性                                                多价血清凝集试验：阳性多价血清凝集试验：阳性沙门菌沙门菌—SS平板菌落形态平板菌落形态沙门菌沙门菌—显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态沙门菌沙门菌—血清凝集试验结果血清凝集试验结果枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌§ §形态特征：形态特征： G G＋＋直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体位于菌体中心或次极端，不小于菌体§ §培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。

在营可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落在营养肉汤培养基中形成菌膜养肉汤培养基中形成菌膜, ,很少混浊或不混浊很少混浊或不混浊§ §分离培养：营养琼脂平板分离培养：营养琼脂平板                                                  血琼脂平板血琼脂平板枯草芽孢杆枯草芽孢杆—琼脂平板的形态琼脂平板的形态枯草芽孢杆枯草芽孢杆—显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态真菌的初步鉴定试验真菌的初步鉴定试验§标本直接检查标本直接检查——显微镜检查显微镜检查§真菌的分离培养真菌的分离培养⑴⑴. .酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落形态与一般酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落形态与一般细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落⑵⑵. .霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落菌落成棉絮霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落菌落成棉絮状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。

§快速显色鉴别培养法：经快速显色鉴别培养法：经3737℃℃1 1～～2d2d就能显示结就能显示结果如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉果如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐变成黑色变成黑色霉菌各种菌落形态霉菌各种菌落形态白色念珠菌白色念珠菌§形态特征：形态特征： G G＋＋、圆形或卵圆形、着色不均匀、、圆形或卵圆形、着色不均匀、在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子§培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌落培养稍久，菌落增大在改良马丁培养基中落培养稍久，菌落增大在改良马丁培养基中呈沉淀生长呈沉淀生长§分离培养：快速显色培养基分离培养：快速显色培养基白色念珠菌白色念珠菌—显色平板的形态显色平板的形态白色念珠菌白色念珠菌—显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态黑曲霉黑曲霉§形态特征： 单层和双层瓶梗、孢子头球形放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。

§培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成菌落初为白色羊毛状 ，继而黑色或黑褐色，粗绒状§分离培养：快速显色培养基 黑曲霉黑曲霉—显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态 黑曲霉黑曲霉—电镜下菌体形态电镜下菌体形态菌种传代的工作环境、工具及其他器皿菌种传代的工作环境、工具及其他器皿§ §环境环境1 1、洁净工作室：环境洁净度、洁净工作室：环境洁净度1000010000级下的局部级下的局部100100级的单向流空气区级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染防止微生物污染2 2、无菌隔离舱、无菌隔离舱§ §工具工具1 1、接种环、接种环2 2、接种针、接种针3 3、接种铲、接种铲4 4、接种钩、接种钩5 5、酒精灯及其他玻璃器械、酒精灯及其他玻璃器械§ §培养所用器具培养所用器具1 1、玻璃器皿：如各种规格培养皿玻璃器皿：如各种规格培养皿2 2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等菌种的接种操作步骤菌种的接种操作步骤一一.  . 斜面接种法：斜面接种法：1. 1. 从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约3030        分钟。

分钟2. 2. 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明        菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或        超净工作台打开紫外灯照射一小时超净工作台打开紫外灯照射一小时3.3.关闭紫外灯点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将关闭紫外灯点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将      管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环      烧红约烧红约3030秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧      灼，往返通过三次灼，往返通过三次4.4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口      在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种      环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后      再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将      菌种管口移至火焰上方。

　菌种管口移至火焰上方　   5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼  脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌7.将已接种好的细菌管置35～37℃细菌培养箱培养22 ～24h，霉菌管置23～28℃霉菌培养箱培养7天二. 穿刺接种法：      用接种针取细菌少许，从培养基的中央垂直刺入，接近管底但不接触管底，然后接种针沿穿刺线原路退出       主要用于生孢梭菌的传代三.液体接种法：     用接种针取菌少许，在试管内壁与液面交    界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养液中黑曲霉接种方法：黑曲霉接种方法：§ §黑曲霉孢子悬液，可以保存在黑曲霉孢子悬液，可以保存在4 4℃℃环境，并应在一个月内环境，并应在一个月内尽快完成转种操作转种操作应在超净工作台（或相当此尽快完成转种操作转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无菌吸管吹吸管内液体，取菌吸管吹吸管内液体，取1 1～～2 2滴滴在改良马丁琼脂斜面，滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置用吸管涂布均匀，置2323～～2828℃℃培养培养5 5～～7 7日，培养斜面形态日，培养斜面形态可参照下图。

可参照下图   § §如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色§ §转种完毕的冻存管和使用过的器具应经转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121121℃℃湿热灭菌湿热灭菌3030分钟再作处理分钟再作处理菌种的保藏 菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义一、菌种保藏的目的n 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、二、菌种保藏的原理§首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等§其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态§尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法§各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。

§ 斜面低温保藏法§甘油冷冻管保藏法§试管熔封（密封）保藏法§石蜡油封藏法§砂土管保藏法§麸皮保藏法§冷冻真空干燥保藏法§液氮超低温保藏法（一）斜面低温保藏法－常用保藏法§ §将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于后，置于4℃4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续如此连续§ §此法适用于此法适用于细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏短期保藏短期保藏. .§ §此法的主要保藏措施是低温一般可保存此法的主要保藏措施是低温一般可保存1 1～～6 6个月左右个月左右§ §优点：优点：简便简便易行易行、、容易推广，容易推广，适用于大多数微生物适用于大多数微生物§ §缺点缺点：：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短；保藏期短；传代次数多；传代次数多；菌种菌种容易发生变异容易发生变异和被和被污染（二）甘油冷冻管保藏法甘油冷冻管保藏法§将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调正菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第调正菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第1010号管，号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%20%的无菌甘油，得到的无菌甘油，得到10%10%甘油菌悬液。

轻轻振摇小甘油菌悬液轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装无菌小管，最好在管，使内容物充分混合，分装无菌小管，最好在-30℃-30℃条件下储存，一般可保存条件下储存，一般可保存2 2年年. .（三）试管熔封（密封）保藏法（三）试管熔封（密封）保藏法§熔封 用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养菌后，经接种，室温培养2424～～48h48h后，将接种菌后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存使用时，用砂轮在管口划一圈，温和冰箱下保存使用时，用砂轮在管口划一圈，在乙醇灯下火烟灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上室温保存期可达室温保存期可达3 3年，特别是年，特别是适宜一些因培养物陈旧极易死亡的铜绿假单菌适宜一些因培养物陈旧极易死亡的铜绿假单菌§密封 将需保存种菌按无菌操作要求接种至固体培养基塞紧棉塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林，盖紧后使之与真空泵相连接开动真空泵抽真空30min至1h（真空度约为640）关闭密封口，§拨出胶塞，置于室温下保存待用时，打开盖，取出种菌，接种至培养基上即可。

（四）石蜡油封藏法§此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm1cm，，使培养物与空气隔绝，使培养物与空气隔绝， 加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃4℃冰箱内保藏冰箱内保藏§此法的主要保藏措施是低温、阻氧一般可保存此法的主要保藏措施是低温、阻氧一般可保存1 1～～2 2年左右（五）冷冻真空干燥保藏法§ §又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法它通常是用保护剂制又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块并在真空条件下立脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

处于休眠状态，而得以长期保藏n此法适用于各大类微生物n此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂， 保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前 被广泛采用的一种较理想的保藏方法n该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设 备（六）液氮超低温保藏法§简称液氮保藏法或液氮法它是以甘油、二甲基简称液氮保藏法或液氮法它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃196℃））下保藏的方法其主要原理是菌种细胞从常温过下保藏的方法其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤成冰晶而使细胞损伤§ §此法适用于各种微生物菌种的保藏此法适用于各种微生物菌种的保藏§ §此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到可达到1515年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。

技术之一§ §此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏其缺点是需购置超低温液氮设备，的微生物进行保藏其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高且液氮消耗较多，操作费用较高菌种的保藏条件及时间菌种的保藏条件及时间菌液的制备菌液的制备§取铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中置35～37℃细菌培养箱培养18 ～24h；白色念珠菌的新鲜培养物少许   接种至改良马丁培养基中置23～28℃霉菌   培养箱培养48h§黑曲霉的菌液制备：        将黑曲霉的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃霉菌培养箱培养5～7天，使大量的孢子产生加入3 ～5ml的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱，然后，用一支管口塞有无菌棉花的无菌球形毛细吸管吸出孢子菌液至无菌试管内，可用比浊法或玫瑰红钠琼脂培养基注皿（1ml），按规定条件培养后计数菌液的稀释方法菌液的稀释方法细菌的生长曲线细菌的生长曲线细菌群体的生长繁殖可分为四期：细菌群体的生长繁殖可分为四期：   一期：迟缓期（一期：迟缓期（一期：迟缓期（一期：迟缓期（lag phaselag phase））））                细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。

此期曲线平坦过程（不适应者可因转种而死亡）此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少迟缓期长短因种类、接稳定，因为细菌繁殖极少迟缓期长短因种类、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1 1～～4 4小时此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细小时此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物         二期：对数期二期：对数期二期：对数期二期：对数期(logarithmic phase)(logarithmic phase)              又称指数期又称指数期(exponential phage)(exponential phage)此期生长曲线上活菌此期生长曲线上活菌数直线上升细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几数直线上升细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）此期细菌小至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。

抗生素作用，敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳对该时期的细菌效果最佳三期：稳定期（三期：稳定期（三期：稳定期（三期：稳定期（stationary phasestationary phase））））              该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、化较大由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2H2O2等）积累等）积累phph下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡细菌形态、染色、生物活性可出增殖数与死亡数渐趋平衡细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽胞等素、以及芽胞等四期：衰亡期（四期：衰亡期（四期：衰亡期（四期：衰亡期（decline phasedecline phase））））                  随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增增多。

活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸多活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形生理代谢活动趋于形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形生理代谢活动趋于停滞故陈旧培养物上难以鉴别细菌故陈旧培养物上难以鉴别细菌    细菌的分离培养技术细菌的分离培养技术—平板划线分离法平板划线分离法§一一. .连续划线分离法：此法用于含菌量少的菌液连续划线分离法：此法用于含菌量少的菌液先将培养物于平板先将培养物于平板1/51/5处密集涂布，然后来回做处密集涂布，然后来回做曲线连续划线接种，线于线之间有一定的距离，曲线连续划线接种，线于线之间有一定的距离，划满平板为止划满平板为止§二二. .分区划线分离法：此法用于含菌量多的菌液分区划线分离法：此法用于含菌量多的菌液先将培养物涂布于平板表面边缘第一区，约占平先将培养物涂布于平板表面边缘第一区，约占平板板1/51/5面积，再在二、三、面积，再在二、三、……区依次连续划线区依次连续划线每划完一个区，均将接种环灭菌一次每一区的每划完一个区，均将接种环灭菌一次每一区的划线均接触上一区的接种线划线均接触上一区的接种线1 ~ 21 ~ 2次，使菌量逐次，使菌量逐渐减小，以获得单个菌落。

渐减小，以获得单个菌落细菌分离培养的直观图细菌分离培养的直观图纯培养纯培养§ 所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡                                    谢谢大家！。