苛养菌的分离与鉴定ppt课件.ppt

苛养菌的分离和鉴定 卫生部北京医院检验科陈东科 2019 1 概述 苛养菌 fastidiousmicroorganism 是一类生长需要特殊营养物质的细菌 与许多感染性疾病有关 其分离培养较为困难 由这些菌引起的感染发病率一直难以估计 因此 对苛养菌的分离鉴定和药敏试验不仅是临床迫切的需要 同时也是衡量一个细菌室技术水平的重要标志 2019 2 临床上常见的可养菌 肺炎链球菌 卡他莫拉菌 非严格的苛养菌 HACEK 细菌群H代表嗜血杆菌属 Haemophilus A代表放线杆菌属 Actinobacillus C代表心杆菌属 Cardiobacterium E代表艾肯菌属 Eikenella K代表金氏菌属 Kingella 4 其它苛养性细菌 如淋球菌 脑膜炎球菌 军团菌 巴斯德氏菌 布氏杆菌 鲍特氏菌 念珠链杆菌 碳酸噬胞菌等 2019 3 一 肺炎链球菌的分离和鉴定 肺炎链球菌 S pneumoniae 俗称肺炎球菌 pneumococcus 经常寄居于正常人的鼻咽腔中 一般不致病 只形成带菌状态 当机体免疫力下降时才致病 尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿 老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染 2019 4 肺炎链球菌很少产生外毒素 主要靠荚膜侵袭力致病 肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎 肺炎后可继发胸膜炎 脓胸 也可引起中耳炎 乳突炎 副鼻窦炎 支气管炎 心内膜炎 腹膜炎 关节炎 脑膜炎和败血症等 2019 5 细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值 同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义 2019 6 一 生物学性状 2019 7 1 形态与染色 肺炎链球菌革兰染色呈阳性 球形或矛头状 成双排列 少呈链状 在组织中可形成荚膜 人工培养荚膜逐渐消失 无鞭毛及芽孢 2019 8 2019 9 2 培养特点 1 培养基肺炎链球菌对营养要求较高 需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液 5 马血或羊血 琼脂浓度可适当下降至1 1 2 有利于肺炎链球菌的生长 2019 10 2 分离培养 1 标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提 因为 肺炎链球菌对干燥 对寒冷的抵抗力均较弱 在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中 其存活率十分低 不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因 2019 11 2 选择性分离培养基 培养基中添加5 g ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离 2019 12 3 培养环境 5 10 CO2 35 培养24 48h 2019 13 3 肺炎链球菌的菌落形态 在营养丰富的培养基上 肺炎链球菌形成扁平 中间有凹陷的典型菌落 少数菌可呈粘液型菌落 2019 14 2019 15 肺炎链球菌 2019 16 2019 17 3 抗原结构 1 种属特异性抗原 为菌体多糖抗原 存在于肺炎链球菌的细胞壁 2 型特异性抗原 是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体 可溶于水 据此抗原可将肺炎链球菌分为 等个型 其中 型致病性最强 3 菌体核蛋白抗原 存在于菌体深部 为蛋白质 无特异性 2019 18 二 肺炎链球菌鉴定 肺炎链球菌的鉴定 主要应与甲型溶血性链球菌鉴别 其中以胆汁溶菌试验 菊糖发酵和optochin试验最为常用 必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别 在上述试验中 肺炎链球菌均应阳性 而甲型溶血性链球菌为阴性 必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定 2019 19 肺炎链球菌鉴定要点 革兰阳性双球菌 矛头状 不呈链 血平皿菌落呈草绿溶血 湿润 菌落表面无小白点 培养时间长出现脐窝状 胆汁溶解试验阳性 乳胶单克隆抗体凝集阳性 2019 20 口腔链球菌 2019 21 2019 22 1 溶血性检查 肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强 草绿色溶血环很大 可与其他草绿色链球菌相区别 2019 23 2 Optochin OP 敏感试验 optochin即乙基氢化叩卟啉 因结构似于奎宁 故又称为乙基氢化羟基奎宁 该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成 optochin敏感试验方法似药敏试验 挑取被检菌 密涂于血平板上 贴上含5 g 片的optochin纸片 置5 10 CO2的大气中 或烛缸 35 孵育过夜 抑菌环直径 14mm为敏感 推断为肺炎链球菌 抑菌环直径 14mm时参照胆汁溶菌试验 肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上 甲型溶血性链球菌 约98 小于12mm 2019 24 也有例外 我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌 并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径 14mm 应注意鉴别 但大多数肺炎链球菌对苯唑西林 Oxacillin OX 是敏感的 除外PRP 而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药 这可作为辅助鉴别点 2019 25 2019 26 肺炎链球菌 2019 27 2019 28 2019 29 2019 30 3 胆汁溶菌试验 自溶酶是一种L 丙氨酸 N 乙酰胞壁酰胺酶 能切断肽聚糖上L 丙氨酸与N 乙酰胞壁酸间的连接键 从而破坏细胞壁 使菌溶解 自溶酶在菌生长的稳定期被激活 也可被胆汁或胆盐等活性物质激活 从而促进培养物中的菌体溶解 肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性 甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性 2019 31 1 试管法 取新鲜培养物分装于两支试管内 每支1ml 其中一支加入10 的去氧胆酸钠溶液0 1ml或纯牛胆汁0 2ml 另一支加入无菌盐水两滴 对照 15min后 阳性者细菌被溶解 试管内液体呈透明状 阴性者无变化 2019 32 2019 33 2 平皿法 加一滴10 的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上 15min后 阳性者细菌菌苔被溶解 阴性者无变化 试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照 2019 34 2019 35 胆溶阴性 2019 36 4 乳胶凝集试验 结果准确 快速 特异性高 2019 37 2019 38 5 荚膜肿胀试验 取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀 加少量美蓝液混合后加盖片 室温10 20min后 用油镜检查 如查到菌体呈兰色 周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性 可用于肺炎链球菌的分型 2019 39 6 凝集试验 包括血清凝集试验 SPA 葡萄球菌蛋白A 协同凝集试验 反向乳胶凝集试验等方法 2019 40 表1非 溶血链球菌的鉴别 菌种Optochin胆汁胆汁6 5 NaCl吡咯烷卫星现象CAMP血清群敏感溶菌七叶苷肉汤酮酶 肺炎链球菌 牛链球菌 D无乳链球菌 d B草绿色链球菌 营养变异链球菌 某些菌可能敏感d 不同菌株 2019 41 三 致病性 肺炎球菌的致病力 主要是荚膜的抗吞噬作用 有荚膜的光滑 S 型菌有毒力 失去荚的粗糙 R 型毒力减低或消失 荚膜多糖本身对机体无直接毒性作用 但可与血液中相应抗体发生特异性结合 从而消耗体内的抗荚膜特异性抗体 肺炎球菌自溶后能释放出溶血毒素 O PenemolysinO 能溶解人和动物的红细胞 高浓度对动物有坏死及致死作用 在新分离培养物中尚有神经氨酸酶 能分解细胞糖蛋白和糖脂的末端N 乙酰神经氨酸 该酶对肺炎球菌在鼻咽部和支气管粘膜上定居和繁殖可能有一定作用 2019 42 四 防治原则 除一般防止呼吸传染之措施外 目前已试用荚膜多糖菌苗接种 效果良好 根据药敏试验 可选用敏感的抗生素 青霉素 林可霉素 四环素等 进行治疗 2019 43 五 肺炎链球菌的药敏试验 K B法 采用Mueller Hinton琼脂 5 羊血培养基 直接菌落悬液法 0 5麦氏单位菌液 在15分钟内接种完 作为接种液 稀释法 包括琼脂稀释法 肉汤稀释法和Etest法 培养条件 为35 5 CO2培养20 24小时 质控菌株ATCC49619 2019 44 1 肺炎链球菌的耐药机制 1 青霉素G耐药肺炎链球菌 PRP 的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白 PBP 发生改变 因为PBP1a 1b和PBP2a 2x 2b是 内酰胺类抗生素的作用靶位 改变后使PBP与青霉素G的结合力下降 青霉素G耐药肺炎链球菌 PRP 始发现于1967年 多重耐药肺炎链球菌 MDR 1977年首次在南非爆发流行 2019 45 2 肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致 2019 46 3 肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变 即核糖体50S亚单位改变所致 由ersB erythromycinresistancemethylase 基因介导 其耐药表型为MLS 即对大环内酯类 林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药 另一耐药机制为主动外排系统 由mefA基因介导 其耐药表型为M 即对14元环 红霉素 罗红霉素 克拉霉素 地红霉素 氟红霉素 15元环 阿奇霉素 大环内酯类低水平耐药 而对16元环大环内酯类 罗他霉素 柱晶白霉素 交沙霉素 麦迪霉素 麦白霉素 螺旋霉素 乙酰螺旋霉素 米欧卡霉素 林可霉素和链阳霉素B敏感 2019 47 耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径 1 克隆传播 是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区 2 基因水平转移 是把耐药基因转移到敏感菌株中 过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素 一般认为在抗生素的压力选择下 敏感菌株被杀死 耐药菌株确能生存下来 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播 研究发现证实儿童鼻咽部存在 隐匿性耐药克隆株 随着我国儿童 内酰胺类抗生素大量使用 可以预计不久的将来 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加 2019 48 2 耐青霉素肺炎链球菌的检测 纸片扩散法对 内酰胺类药物结果的准确性不够 用1 g 片苯唑西林 OX 筛选肺炎链球菌对青霉素耐药时 当抑菌环直径小于20mm时 就必须做稀释法证实是耐药 2019 49 2019 50 3 肺炎链球菌的药敏报告 用1ug 片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性 当抑菌环 20mm或MIC 0 06ug ml可报告青霉素敏感 并同时可报告氨苄西林 阿莫西林 阿莫西林 克拉维酸 头孢克罗 头孢地尼 头孢吡肟 头孢他美 头孢克肟 头孢噻肟 头孢丙烯 头孢曲松 头孢呋辛 头孢泊肟 头孢唑肟 亚胺培南 氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性 2019 51 肺炎链球菌的药敏报告 续1 当苯唑西林抑菌圈 19mm时应确定青霉素 头孢噻肟或头孢曲松的MICs 因为抑菌环 19mm可以发生在青霉素耐药 中介或敏感菌株中 2019 52 肺炎链球菌的药敏报告 续2 当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌 应常规报告MICs 测定的药物应包括青霉素 头孢噻肟或头孢曲松 美罗培南和万古霉素 2019 53 六 肺炎链球菌感染的治疗 青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进行治疗 如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉素或利福平进行治疗 2019 54 总结 1 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中 是条件致病菌 2 肺炎链球菌对营养要求较高 在含有新鲜血液的培养基中生长良好 3 以optochin试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌与其他 溶血链球菌相区别 4 血清学鉴定特异性高 5 要注意对PRP和MDR的检测 2019 55 2019 56 二 嗜血杆菌的分离和鉴定 嗜血杆菌属 Haemophilus 属于巴斯德菌科 是专性寄生的苛养性细菌 该属细菌主要寄生在人的咽喉及口腔粘膜 少见于消化道和生殖道 其中流感嗜血杆菌主要引起人类急性化脓感染 急性咽炎 喉炎 气管炎 肺炎 中耳炎 鼻窦炎 心内膜炎 败血症 脑膜炎等 及严重的继发感染 杜克雷嗜血杆菌是引起软性下疳的病原菌 本属细菌对营养要求严格 生长时需血液中存在的生长因子 人工培养时必须供给新鲜血液才能生长 故名 嗜血杆菌 2019 57 寄居在人体的嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 H influenzae 副流感嗜血杆菌 H parainfluenzae 溶血嗜血杆菌 H haemolyticus 副溶。