玉米赤霉烯酮ZEA检测操作规程.docx

44k 大康地2012-XX-XX 定稿参照Romer AgraQuant®玉米赤霉 烯酮（F-2毒素）检测试剂盒 （25-1000ppb ）操作方法■ ■尺■ CHIA TAI CONTI编制人审核人批准人玉米赤霉烯酮ZEA检测操作规程1 原理AgraQuant®玉米赤霉烯酮检测试剂盒应用固相直接竞争酶联免疫吸附原理，用70% 甲醇从研磨样品中提取玉米赤霉烯酮样品提取液或玉米赤霉烯酮标准品与酶-玉米赤霉烯 酮偶合物混匀后加入到抗体包被的微孔中，样品中的玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮标准品 与酶-玉米赤霉烯酮偶合物中的玉米赤霉烯酮竞争结合微孔中的特异抗体经过洗板去除未 参加抗原-抗体反应的的玉米赤霉烯酮，当酶的底物被加入到微孔中，颜色变为蓝色，且颜 色深浅与样品中或标准品中玉米赤霉烯酮含量成反比加入反应终止液终止反应后，反应 液颜色应由蓝色转为黄色在450nm（OD450）滤镜及630nm示差滤镜下使用酶标仪对微孔板 进行吸光度值测量利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品的吸光度 值与标准品的吸光度值进行比较以进行结果的判读2 试剂与仪器2.1单道移液枪（量程：0〜200pL、0〜lOOOpL）2.2八道移液枪（量程：0〜300pL）2.3 定时器2.4 吸水纸2.5 试剂槽3个2.6 仪器：酶标仪3 操作步骤3.1 样品的准备/萃取3.1.1 获取具有代表性的样品，使用研磨机研磨，使至少 95%的研磨样品能够通过 20 目 筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。

3.1.2称取20g研磨样品于干净并可密封的广口瓶中3.1.3加入100mL 70/30（v/v）甲醇水萃取溶液并密封广口瓶注意：样品与萃取溶液比 例应为1:5 （w:v）3.1.4 摇床上振荡混合10分钟3.1.5 静置样品，用双层滤纸过滤萃取上清液，收集待检滤液（滤液必须澄清）44k 7T大康地2012-XX-XX 定稿参照Romer AgraQuant®玉米赤霉 烯酮（F-2毒素）检测试剂盒 （25-1000ppb）操作方法■ ■尺■ CHIA TAI CONTI编制人审核人批准人3.1.6用70%甲醇溶液对滤液进行1:5稀释例如：将ImL萃取滤液加入4mL70%甲醇溶 液中，混匀准备进行随后实验3.2 检测步骤3.2.1 将蓝色的稀释孔条放入微孔板架上，稀释条孔的数目需使每个标准品（0, 25, 100, 300 & 1000ppb ）或样品能够对应一个稀释孔3.2.2 将等量的有抗体包被的微孔条放入微孔板架上，未使用的有抗体包被的微孔条需放 回装有干燥剂的原铝箔袋内并密封保存3.2.3按照120 yL/孔或1 mL/条的体积计算所需的酶联偶合物用量从绿色瓶盖的瓶中量 取所需用量的酶联偶合物至一个酶联偶合物试剂槽中（如多道移液器所用的试剂 槽）。

使用8道移液枪移取100皿酶联偶合物至每个蓝色的稀释孔中3.2.4使用单道移液枪，移取50皿标准品和样品至已装有100吐酶联偶合物的稀释孔中 用移液枪反复吸送3次以充分混合孔中溶液每当移取一个标准品或样品时，移液 枪必需更换上新吸头注意确保最后将吸头中的液体排空3.2.5使用换有全新吸头的8道移液枪，快速移取每个稀释孔中的液体各100皿至相应的 有抗体包被的微孔中 室温下放置 10分钟注意不要摇动微孔板，以免引起孔与 孔之间的污染3.2.6 将5段吸水纸巾放置在平整的桌面上，每段4层3.2.7 将孔中的液体甩入水槽中，用去离子水冲洗每个孔 （小心加入不能使去离子水溢 出），加入去离子水间隔7-10s后将微孔中的水甩入水槽中将微孔板倒置扣击纸面, 以尽可能地将残留的水分排出如此方式反复冲洗4次注意在冲洗过程中不要将 微孔条从微孔板架上取下，每条微孔条带应被固定在微孔板架上 不能长时间使干 燥的微孔条暴露于空气中3.2.8 冲洗完毕后，将微孔板倒置扣击纸面，以尽可能地将残留的水分排出用干布或纸 巾擦干微孔板底反面的水珠3.2.9按照120 yL/孔或1 mL/条的体积计算所需的底物用量从蓝色瓶盖的瓶内量取所需 用量的底物至一个底物试剂槽中（例如适用于8道移液枪的试剂槽中），使用 8道 移液枪移取100gL底物至每个微孔中，室温下放置5分钟。

3.2.10按照120 yL/孔或1 mL/条的体积计算所需的终止液用量从红色瓶盖的瓶中量取 所需用量的终止液至一个终止液试剂槽中（例如适用于 8 道移液枪的试剂槽中），44k 大康地2012-XX-XX 定稿参照Romer AgraQuant®玉米赤霉 烯酮（F-2毒素）检测试剂盒 （25-1000ppb ）操作方法■ ■尺■ CHIA TAI CONTI编制人审核人批准人使用8道移液枪依序（顺序与加入底物的顺序相同）向每个微孔中加入100“L终止 液终止反应颜色应由蓝变黄4 计算用酶标仪在 450nm 滤镜及示差滤镜 630nm 下读取结果，记录每个微孔的吸光度 OD 值注意在读取数据前，微孔中应没有气泡，否则将影响分析结果5 注意事项5.1试剂盒在不使用时，需放置在2~8°d呆存，并确保在有效期内使用；在使用前，所有 试剂及试剂盒内的材料必须恢复至室温18~30°C5.2应保证样品萃取液的pH值为6〜8pH值过高或过低均会影响检测结果，应在过滤前 用NaOH或HC1对样品萃取液予以调整5.3 建议若使用 8道移液枪进行操作，在一次试验中样品及标准品的总量不超过48个（6 个检测条）； 建议若使用单道移液枪进行操作，在任何一次实验中样品及标准品的总 量不要超过 16个（2个检测条）。

5.4 酶联偶合物与标准品或样品的比例应保持 2:1，但是酶联偶合物与样品量可以减少， 例如使用100吐酶联偶合物，50吐样品或标准品从稀释孔中转移到有抗体包被的 孔中的混合液仍然保持100yL不变不能将任何未使用的或用剩的试剂倒回原装瓶中 检验过程中应分清样品与标准品的位置且在整个检验过程中，任何时候都不允许摇 动微孔板以混合孔内液体5.5使用Log/Logit软件计算结果，其标准曲线的线性相关系数（r八2）不得低于0.985, 若标准品0ppb的吸光度值低于0・5,即表示试剂已变质，请勿继续使用；若试剂盒仍 处于保质期内，请及时与供应商联系5.6若样品所含玉米赤霉烯酮浓度高于标准品的最高浓度（＞1000ppb）,则需将萃取过滤 的溶液再次用70%的甲醇稀释到试剂盒检测范围25-1000ppb内，重新检测以得到精确 的结果在最后的结果计算中，注意要将稀释倍数算入6 性能指标6.1 检测限(Limit of detection): 20 ppb6.1 定量限(Limit of Quantitation)： 25 ppb44k 大康地2012-XX-XX 定稿参照Romer AgraQuant®玉米赤霉 烯酮(F-2毒素)检测试剂盒 (25-1000ppb )操作方法■ ■尺■ CHIA TAI CONTI编制人审核人批准人6.1定量范围(Range of Quantitation)： 25-1000ppb (对于超过lOOOppb的样品，应将其稀释至定量范围再做检测)。