AA复方氨基酸注射液细菌内毒素检查法的实验研究.doc

20AA复方氨基酸注射液细菌内毒素检查法的实验研究夏曙辉，徐金华，王银娟，钱琳娜(南京军区南京总医院江苏南京210002 )摘要：目的 研究20AA复方氨基酸注射液対细菌内毒素检查试验的T•扰情况，建立其细菌 内毒素的限量检查方法方法 参照《中国药典》2005年版二部附录细菌内痔素凝胶限量 检查法进行实验，以不同生产厂家、不同批号的蛍试剂对多批供试品进行干扰试验研究结 果20AA复方氨基酸注射液经4倍稀释后对检测无T•扰作用结论 该制剂可用细菌内毒 素检杳法替代家兔热原检查法控制产品质最，其内毒素限值为每ml含内毒素量应小于1.2 EU关键词20AA复方氨基酸注射液；细菌内毒素凝胶限量检查法；T•扰试验Study on bacterial endotoxin test method for 20AA Compound Amino Acid InjectionXIAShu-hui , XU Jin-hua , VWJGYin-juan , QIAN Lin-na(Nanjing General Hosp让al of Nanjing Command, Nanjing 210002)ABSTRACT： Aim To study the interference of 20AA compound amino acid injection in bacterial endotoxin test , and to establish a method of endotoxin lira让 test for the preparation. Methods The bacterial endotoxin test is performed according to the bacterial endotoxin determination method in China Pharmacopoeia 2005, using different tachypleus a mebocyte lysate (TAL) made in more manufacturers. Results In four times diluted concentration, the 20AA compound amino acid injection did not interfere in the result of the test. Conclusion In place of rabbit pyrogen method ,the gel-clot test of bacterial endotoxin could be used for control the quality of 20AA compound amino acid injection , in which the bacterial endotoxin limit should be less than 1.2 EU ・ m L1.KEY WORDS : 20AA compound amino acid injection； gel-clot test method of bacterial endotoxin ； Interference test复方氨基酸注射液是医院常川制剂，主要用于蛋白质摄入不足、吸收障碍等氨基酸不 能满足机体代谢需要的患者。

根据临床川途以及制剂内含氨基酸种数的不同，冃前冇6种氨 基酸(6AA)、13种氨基酸(13AA)、18种氨基酸(18AA)等多种复方氨基酸注射液我 院根据临床需要率先开发研制岀含20种氨基酸的复方氨基酸注射液(简称20AA),它在促 进机体康复，加速创伤愈合，抗DNA氧化损伤等方血功效显苦，是我院肠外特色营养支持 疗法的重要制剂为安全有效地控制20AA产品质量，本文参照《中国药典》2005年版二 部附录细菌内毒素检查法⑴进行系列实验研究，探讨以细菌内毒素检查法収代家兔检查法用 于20AA复方氨基酸注射液质量控制的可行性，収得了满意的结果1实验仪器与材料ZH-2自动旋涡混合器（天津药典标准仪器厂）；BET细菌内毒素检查仪（天津药典标 准仪器厂）所用的试管、刻度吸管等均经250C干烤lh以上去热原细菌内毒素工作标准品（CSE）：批号2005-6, 100EU •支"（中国药品生物制品检定 所）；蛍试剂（TAL）：标示灵敏度（入）为0.25EU -mL1,批号0701040、0506312,（湛江安 度斯生物冇限公司）；蛍试齐IJ（TAL）：标示灵敏度（入）为0.25EU・m「，批号0703071、0603240, （湛江博康海洋生物冇限公司）细菌内毒素检查用水（WBET）：规格10mL-支"，批号 070525,（湛江博康海洋生物有限公司）。

20AA：批号分别为061226、070507、070614 , 规格250mL （本院制剂科配制，家兔热原检查法均符合规定）2方法与结果2. 1蛍试剂灵敏度（入）的复核 按照《中国约典》2005年版二部蛍试剂灵敏度复核试 验法进行，所用的堂试剂灵敏度（入）在0.5 ~ 2.0 间，均符合规定2. 2细菌内毒索限值（L）的确定⑴ 根据公式（pL=K/M计算供试品的细菌内毒素测 定限值式中K为按规定的给药途径人用每kg体重每h最大口J接受的内毒素剂量，以 EU・kg L『表示注射剂的K为5.0 EU kg^-h1；式中M为人用每kg体重每h授大供试 品用量，以mL kg -h1表示20AA临床最大用量为每次250mL,约lh左右滴注完，人均 体重按60kg计算,则M = 250mL/60kg・h"=4.2 mL・kg"・h"将上述K、M两值代人公 式⑴中,则 L=K/M = 5.0EU •kg_1-h,/4.2mL-kg1-h1= 1.2 EU ・ml/由此确定 20AA 的 细菌内毒素限值为1.2 EU mL o2.3供试品的十扰试验以确定供试品在多少稀释倍数下对内毒素和蛍试剂的凝集反应不 产生干扰作用，为能否进行细菌内毒素检查提供依据。

2. 3. 1最大有效稀释倍数（MVD）的确定 按公式⑵MVD = CL/X计算式中L为供 试品的细菌内毒素限值，入为测试川蛍试剂的灵敏度标示值，C表示供试品的浓度，当限值 单位为EU mL1时,C等于1.0 mL mL o目前市售蠻试剂灵敏度通常在0.5 EU mL1〜 0.03 EU 51?之间,对应的冇效稀释倍数为》：MVD0.5= 1.2 EU -mL70.5 EU ・mL~2.4倍, MVDo,o3=1.2 EU 5「/0.03 EU 5「=40倍，可在此冇效稀释范围内进行内毒素检测实验2. 3・2 干扰预试验 用WBET将20AA进行1->2、1-4、1->8、1-16、1-40稀释, 作为NPC系列，同时制备具冇相同稀释度并冃■每样品中均含2入内毒素浓度（0.5EU -mf1） 的供试液，作为PPC系列取两个厂家的TAL （ X为0.25EU • mL1）分别与NPC、PPC系 列反应，并按常规设阳性悖和阴性管进行检测结果见表1表1供试品干扰预试验结果Tab 1 the results of preinterference testTAL供试品稀释倍数PC NC批号系列原液1-*21-41-*81-161 一 400701040NPC+ + ——PPC————+ ++ ++ ++ +0703071NPC+ + ——PPC————+ ++ ++ ++ +预试验结果表明，20AA原液对卷试剂凝集反应冇抑制作丿1],原液经1->4以上稀释 即不存在干扰现彖，初步判定1-4稀释度为20AA的最大不干扰浓度。

2. 3・3正式十扰试验 用WBET和1-4稀释后的两个批号20AA供试液分别将同一支 CSE制成含内毒素浓度为0.5、0.25、0.125、0.0625 EU・mL」的系列溶液(分别为WBET 系列和供试品系列)，用两个厂家共4个批号的TAL (入均为0.25EU mL1)同时测定和考 查供试液的干扰情况，每一浓度平行做4支，同时作阴性对照(NC)按公式Es= lg4(SX s/4)和Et= lgJ(》Xt/4)计算并比较系列间的效价值(Es和Et),结果见表2o表2供试品干扰试验结果Tab 2 The results of interference testTAL批号供试品批号细菌内毒素浓度(EU -mL-)阴性对照(NC)效价0.50.250.125 0.06250506312WBET++++++++——Es = 0.25061226+++++++++— —Et = 0.21070507++++++++MM MM—Et= 0.250701040WBET++++++++—Es = 0.25061226++++++++——Et = 0.25070507++++++++——Et = 0.250603240WBET++++++++ ——Es = 0.25061226++++++++—Et = 0.250705071 1 1 4+— Et = 0.211 f IT0703071WBET++++Es = 0.25061226++++Et = 0.25070507+++++++++一一 一一—Et = 0.21结果表明：Es均在0.5入~2.0入范围内，Et均在0.5Es〜2.0EsZ间，符合规定。

由 此确认该试验条件下的供试液无干扰抑制作用，口J作为20AA细菌内毒素的检测方法2. 4样品测定 按公式⑵计算样品测定时的最大冇效稀释倍数20AA的细菌内毒素 限值(L)为1.2 EU-mL1,采用的堂试剂灵敏度(入)为0.25 EU -mL-1,贝ljMVD = CL/入 =1.2 EU • ml?/0.25 EU・mL"= 4.8倍取3批经热原检查合格的20AA,用细菌内毒素检查 川水(WBET)将其1-4.8稀释后，依照中国药典2005年版细菌内毒素凝胶限量检查法⑴ 检测结果见表3表3供试品细菌内毒素检査结果Tab 3 The results of bacterial endotoxins test for samples批号供试品(NPC)供试品阳性对照(PPC)阳性对照(PC)阴性对照(NC)TAL供试品0701()40061226+ ++ +■-070507+ ++ +■ ■070614+ ++ +—0703071061226+ ++ +—070507+ ++ +■ ■070614+ ++ +■ ■3讨论冃前国家药品标准中收载的几种复方氨基酸注射液均采川家兔热原法⑵，rti于该法存在 生物学差异，不易标准化，检测成本高，灵敏度差等问题，采川细菌内毒素检查法取代家兔 法具冇重要的现实意义我们在进行细菌内毒素替代实验的同时也注重考察了制剂附加成分 EDTA、溶液。