
分子生物学 5 DNA 复制.ppt
37页单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,DNA replication,,关于,DNA,复制的基本问题:,,,1,、双螺旋,DNA,复制的基本模型,,,2,、参与,DNA,复制的蛋白质及其作用,,,3,、不同生物中的,DNA,复制,,DNA,复制模型,半保留复制(,semiconservative),,半不连续复制(,semidiscontinuous,),,RNA,引物,,复制方向,,双向复制,bidirectional,(普遍),,单向复制,unidirectional,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5’,3’,5’,3’,Parental strands,Semi-conservative,Conservative,Dispersive,Daughter strands,Meselson-Stahl,实验,,,14,N-,14,N,14,N-,15,N,15,N-,15,N,,,,,,,15,NH,4,Cl,14,NH,4,Cl,20 min,40 min,半不连续复制,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,3,′,3,′,5,′,5,′,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,5,′,3,′,3,′,3,′,5,′,5,′,5,′,3,′,3,′,3,′,5,′,5,′,连续复制,不连续复制,冈崎片段(,Okazaki fragment,),脉冲标记实验,[,3,H]dT,,DNA ligase,缺失实验,半不连续复制的证实,E.coli 1000-2000nt,,真核生物,100-200nt,DNA,复制的方向与复制叉移动的方向,,前导链(,leading strand,),,滞后链(,lagging strand,),RNA,引物,ssDNA or dsDNA,,DNA,聚合酶,,dNTP,,所需其他酶,,No DNA replication,发现,,1. M13 DNA,复制(,E. coli,extract,),,,RNA,聚合酶抑制剂,(rifampicin),,2. Okazaki fragment,不能被,DNase,完全破坏,,,证实,RNA primer (10-12nt),leading strand: RNA,聚合酶,,lagging strand: primase,复制方向,复制子,replicons,,,复制叉,replication fork,,复制泡,replication bubbles,,复制起点,origin,,,原核生物,/,噬菌体,/,病毒,DNA,:,1,个,,真核生物,DNA,:,50000 ~ 100000,个,,复制终点,termini,,环状,DNA,的双向复制(,复制,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,复制起点(,origin,),终点(,terminus,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,参与,DNA,复制的蛋白质,1. DNA,解旋酶(,DNA helicase,),,解开双链,,,ATPase,,Dna B (,E. coli,); PriA (some phage),,2. DNA,螺旋酶,(,DNA gyrase,),,断裂双链,,引入负超螺旋 (,swivel function),,3.,单链结合蛋白(,single strand binding protein, ssb,),,防止单链退火,,,gp32 (T4 phage),;,gp5 (M13 phage),4.,引发酶(,primase,),,,Dna G (,E. coli,),,,引发体,Primosome (primase/ helicase,),,5. DNA,连接酶(,DNA ligase,),,需要能量,,,NAD,(,E. coli,),/ ATP,(真核),,,T4 DNA ligase,(平头),,6. DNA,聚合酶(,DNA polymerase, Pol,),,,Pol,I, II and III,,dNTP,底物;,模板,,,5,′,3,′,,,不能从头合成,Three DNA Polymerases,(,E. coli,),Pol I,,DNA,聚合酶,,,3,′,5,′,,外切核酸酶(校正),,,5,′,3,′,外切核酸酶,,缺口填充 (大缺口),,,DNA,损伤修复,,,Nick translation,(去除引物),,Pol II,,,不是,DNA,复制必需的,,Pol III,,3,′,5,′,,外切核酸酶,dna Q,,DNA,聚合酶(,必需),dna E,,,缺口填充(小于,100bp,),,,Klenow fragment,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,nick,结合,Pol I,引物移动,/ DNA,合成,封闭缺口,降解的引物,DNA ligase,Nick translation,去除引物,5,′,5,′,3,′,3,′,parent,progeny,Composition of,E. coli,DNA Polymerase III Holoenzyme,Subunit Function Subassemblies,α DNA polymerase,,ε,3- to 5- exonuclease Core,,θ Stimulates,ε,exonuclease Pol III’,,τ Dimerizes core,,Binds γ complex,,γ Binds ATP,,δ Binds to β PolIII,,δ’ Binds to γ and δ γ complex,,χ Binds to SSB ( DNA-dependent ATPase ),,ψ Binds to χ and γ,,β Sliding clamp,,,,,解旋酶(,DNA helicase,),单链结合蛋白,,(,SSB,:,,single-stranded,,binding protein,),引发酶(,DNA primase,),DNA,复制的基本模式,,,细菌,DNA,复制,实验系统(,experimental systems,),,,DNA,:噬菌体(,,x174 /T4 /T7,)和质粒,,,cell-free system,:所有必须的蛋白质和其他因子,GATCTNTTNTTTT,TTATNCANA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DnaA+ATP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DnaB,DnaC,,,,OriC,(富含,AT,),细菌,DNA,复制起始,minichromosome (,OriC,+ plasmid,),,复制起始复合体,,,DnaA,(起始点结合蛋白,),,DnaB,(解旋酶),,,DnaC,(装载解旋酶和引发酶),,,HU,(识别并刺激,OriC,,复制),,,Gyrase,(促旋酶),,,SSB,,DnaA,,合成与生长速度相关,,,,,,,,,,,T,Origins,(快速生长的细胞内),,,,,,,,细菌,DNA,复制延长,,θ,,ε,,,,SSB,DnaG,,primase,DnaB,,helicase,Pol III,,,(,/,),引发体(,primosome,),Pol I,、,ligase,,复制体(,replisome,),,,in vivo,,,,,,,细菌,DNA,复制终止,AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT,,TTAATCATACAACATTGATTTCA,,,,,,,,terE/ D / A,terC / B /F,Replication fork 1,Replication fork 2,tus,gene,产物,,复制终止区:,,200 kb,(,DnaB inhibitor),,(~23bp),,DNA,复制,真核生物,DNA,复制:起始,实验系统,,,DNA,:酵母(,14000 kb / 400,复制子),,,SV40,(,5kb,,形成核小体),,,cell-free system,:非洲爪蟾,复制期(,S- phase,),,细胞周期(,G1, S, G2, M,,,G0,),,细胞周期转换点,,,G1/S (R,点,/,哺乳动物,, START/,酵母,),,G2/M,,,DNA,损伤检查点,, DNA,复制检查点,,,纺锤体,组装检查点,,复制子簇(,cluster of replicons,),,,20-50,串联,同时通过,S,期,,早:常染色质,中:异染色质,晚:着丝点和端粒,,复制起始点,,酵母:,ARS,(,autonomously replicating sequence,),,,A,区,:,含最短,11bp,的共有序列(富含,AT,),; B1-3,相邻元件,,,ORC,(,origin recognition complex,),,真核,DNA,复制的起始,F4,真核生物,DNA,复制:延伸和终止,相关酶和蛋白质,,解旋酶:,SV40 large T antigen (in vitro),,,单链结合蛋白,: RP-A,,,replication protein A,,MF1,(,5,′,3,′,外切酶、除去引物),,连接酶,I,(,DNA ligase I,),,,DNA,聚合酶,,,核小体重建 : 新、旧组蛋白组合,,核基质(,nuclear matrix,): 固定起始点簇、复制体,DNA Pol,,: 起始新链合成,,,Pol /,引发酶,,合成,: RNA,引物,, 20~30nt DNA,,,DNA,Pol ,:前导链和滞后链的延伸,,,PCNA,(,proliferating cell nuclear antigen,),,,β,sliding clamp,,,保持聚合酶的持续合成能力,,,RF-C,(,γcomplex,),,催化,PCNA,装载,DNA,,,DNA,Pol ,:可能延伸滞后链,其他功能,,DNA,Pol,β,:,DNA,修复,,,,,,,3,',5,',3,',3,',5,',5,',DNA Pol,,引发酶,RF-C,DNA,Pol ,PCNA,Helicase (T antigen),,,RP-A,MF1,DNA ligase I,端粒复制,关于端粒的两个问题:,,,1.,复制后产生粘性末端(,sticky end,)、染色体不稳定,,,2.,染色体末端,DNA,短缩,,研究端粒的实验系统:,,质粒,,酵母,,线性质粒,-,ARS,+,CEN,+,TEL,(四膜虫),,端粒的结构与复制合成:,,,C,n,(,A/T,),m,n,,1,,,m=1-4,,,3’GGGGTT GGGG,T,,T,5’TTGGGG TTGGGG TTGGGG TTGGGG,3’AACCCC 5’,,,,,,,,,端粒复制,,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG,,...AACCCCAACCCC,AACCCCAAC,5’,3’,3’,5’,dGTP,,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTT,GGGGTT,,...AACCCCAACCCC,AACCCCAAC,5’,3’,3’,5’,dGTP,,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTT,GGGGTTG,,...AACCCCAACCCC,AACCCCAAC,5’,3’,3’,5’,3’,RNA template,,polymerase,,primase,,primase,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG,,...AACCCCAACCCC,CCCCAAC,5’,3’,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG,,...AACCCCAACCCC,CAACCCCAAC,5’,3’,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG,,...AACCCCAACCCC,CCAACCC,CAACCCCAAC,5’,3’,...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG,,...AACCCCAACCCC,AACCCCAACCC,5’,3’,其他,DNA,复制方式,滚环形(,rolling circle,),,单链模板、,3’-OH,缺口、线性多连体(多数复制子) 噬菌体(例 ,X174,),/,真核,rDNA /,细菌,F,因子,,,,,,,3’-OH,5’-P,,,5’,,,,,,,,5’,,D-,环型(,D-loop, displacement loop,),,,双链复制不同步,起始点异位,,动物线粒体,/,植物叶绿体,DNA,基因组,其他,DNA,复制方式,,,,,,,,,,,,,,,,H,L,哺乳类,D-loop,:,500-600bp,,线粒体:一个,-,多个,,叶绿体:,2,个,原核生物和真核生物,DNA,复制的差异,一个复制子,多个复制子,(,复制子簇,),无组蛋白,核小体,(,分离、重组),特定位点的单一事件,许多独立起始事件,,(,S phase,,,cell cycle),无端粒,端粒,Pol III,,DNA Pol,,(含引发酶),,DNA,Pol ,无,核基质,核基质,终止位点,无终止位点,串联体,无串联体,复习题,1. DNA,复制的基本模型是什么?,,2.,参与,DNA,复制的蛋白和酶有哪些?各有什么功能?,,3.,原核,DNA,聚合酶有几种,有什么区别?,,4.,细菌,DNA,复制的起始是如何被调控的?,,5.,为什么真核,DNA,只能在,S,期复制?,,6.,真核端粒,DNA,有什么特点?复制中存在什么问题?如何解决?,,7.,端粒酶,,D,环复制,滚环复制,。
