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高浓度脂肪酸和高浓度胰岛素诱导肝细胞脂质堆积 模型的建立内蒙古自然科学基金（编号2008ZD04043I） 作者：E-mail:cfxylxl@ 李秀丽赤峰学院医学院药理教研室（内蒙古赤峰024000）【摘要】目的利用高浓度脂肪酸和高浓度胰岛素共同刺激，诱导HepG2细胞形成具有明显脂滴熠加特征 的脂质堆积肝细胞模型，并评价小舞碱对该细胞模型脂质堆积的改善作用方法 将HepC；2进行细胞培养12h后， 分组：正常对照组（（on）、模型对照组（Medel）和阳性对照药组（Ber）Ccn细胞仅用培养液培养，Model和 13er加入不同浓度的油酸，后者再加不同浓度的小梁碱，分别观察不同的诱导时间（12 h、24 h、48 h、72 h）对肝 细胞脂质堆积的影响和对小槃碱治疗作用的影响以油红0染色观察细胞内脂滴形成状况，并检测细胞内TG的 含量结果1 n】M油酸钠、5（） nM胰岛素共同诱导48 h的实验条件见肝细胞内有典型的脂滴形成，肝细胞内TG 含量显著升高，差异有统计学意义（P＜（）.（）1）,此条件比较适合样品的筛选结论 成功建立了高浓度脂肪酸和 高浓度胰岛素共同刺诱导HepC；2细胞脂质堆积肝细胞模型，并且评价小舞碱对该细胞模型脂质堆积的改善作用， 确定该细胞模型用于药物筛选的最佳实验条件。

关键词】 肝细胞株HepG2;油酸；胰岛素；脂质堆积； 小聚碱随着生活水平的提高，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease , NAFLD）患病率成倍增长,并且呈现低 龄化趋势在西方国家，脂肪肝的发病率约为20-30%⑴，而 东方国家，山于近年来饮食结构的改变和肥胖人群的增加，非 酒精性脂肪肝病的发病率也呈上升趋势⑵山于它是肝硬化、 肝癌的重要病因⑶，所以已得到学者们的高度重视但NAFLD 的发病过程和发病机制尚不完全清楚，因而开展NAFLI）发病机 制的研究具有十分重要的意义H前，对NAFLI）的研究比较常 见的是采用动物模型，采用细胞模型进行研究的报道较少山 于动物模型存在个体差异较大、研究周期长、费用较高、实验 条件不易控制等不利因索，如能成功建立稳定的NAFLI）细胞模 型，则可为NAFLD发病机制的研究提供一种新手段根据“双 击假说” 中的“第一次打击”肝脏中发生的脂质堆积和脂肪 变性是NAFLD发病机制之一的学说，本实验模拟临床上NAFLD 的微环境，利用高浓度脂肪酸和高浓度胰岛素共同诱导的方法刺激HcpG2细胞形成具有明显脂滴增加特征的脂质堆积 肝细胞模型，并评价小柴碱对该细胞模型脂质堆积的改善作 用，以期为NAFLD的研究提供一种新的手段。

1 .材料和仪器1. 1试剂与药品HepG,细胞株（日本滋贺医科大学友好赠送）；DMEM培养基 （低糖）（批号1342967,美国GIBCO公司）；新生小牛血清 （超级）（批号060704,美国GIBCO公司）:胰酶细胞消化液 （编号C0201, Beyotime公司）；乙二胺四乙酸钠（EDTA） （批号060704,北京化学试剂公司）；牛血清白蛋白（无游离 脂肪酸,第V组分）批号B745764,德国Merck公司）:油酸钠（OA）（批号078K5205,美国Sigma化 学试剂公司）；长效胰岛素（诺和灵N, 40IU/ml）批号J20070042, 丹麦诺和诺德公司）；小粲碱标准品（中国药品生物制品检定所）; 廿油三酯试剂盒（批号103861.201005,北京中生北控生物技术 公司）；其它试剂均为国产分析纯1.2实验设备与仪器：低温高速离心机（德国Heraeus公 司）；酶标仪（U-Quant）美国BIO-TEK公司）；超低温冰 箱（日本SANYO公司）；电子天平（德国赛多利斯公司）； 低速离心机（美国sigma公司）；PH计（美国Fisher Scientific 公司）:超声裂解仪（美国 Fisher Scientific 公司）；高压蒸汽灭菌锅（日本SANYO公司）：超净工作台（哈尔滨东联仪器厂）；二氧化碳培养箱（美国REVCO公 司）:倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）等。

2. 方法2. 1脂质堆积诱导培养液（01）的配制 利用5 mM的油酸 钠溶液、5000 nM的长效胰岛素溶液以及5%BSA的DMEM 培养液、无血清DMEM培养基配制成胰岛素抵抗诱导培养 液，使其终浓度为长效胰岛索100 nM、油酸钠1 mM、1% BSAo2. 2小案碱工作液（10 mM）准确称取3. 36 mg小橐碱充 分溶解于1 ml DMSO中，即得小果碱和榭皮索贮存液4C 保存备用临用前，取用无血清的DMEM （低糖）培养液稀 释贮存液至所需浓度2. 3细胞培养 在37C, 5%C02, 95%空气的培养箱内,用 含10%新生小牛血清、双抗（100 U M/ml青霉素与100 u g/ml链霉素）的低糖DMEM培养液体外传代培养IlepG?细胞 2.4脂质堆积细胞模型的建立 将生长至80%〜90%汇合的IlepG?细胞按照1 X IO,个细胞/亳升的密度接种至48孔 板中，约24小时后,待孔中HepGz细胞生长至80〜90% 汇合时，吸弃旧培养基，再用无菌PBS洗涤1〜2次实验随 机分为空白对照组、模型组、小粲碱组正常对照组细胞仅用 培养液培养；模型对照组和小或碱组在吸弃旧培养液后，每孔 加入500 P 1脂质堆积诱导溶液（I mM油酸浓度，50 nM胰岛 索），小或碱组再加入小疑碱使其终浓度为10UM进行诱导48 小时。

2. 5最佳筛选条件的选择 正常对照组细胞仅用培养液培养： 模型对照组在吸弃III培养液后，分别换上不同浓度的脂质堆积 诱导液诱导（油酸浓度:I mM 0.5 mM及50 nM胰岛素）： 小聚碱组同样换上不同浓度的脂质堆积诱导液，同时分别给予 不同浓度的小或碱（0. 1 PM, 0. 5 u M, 1 u M, 5uM, 10 p M）,根据 文献⑺,分别观察不同的诱导时间（12h、24h、48 h、72 h） 利肝细胞脂质堆积的影响和对小聚碱治疗作用的影响2. 6指标检测2. 6. 1油红0实验⑻ 取油红0贮存液15ml,加入10ml纯水 室温下静置10分钟，用滤器过滤后即为油红吸 48孔板各孔中的旧诱导液,每孔用各1 PBS洗涤1〜2次后, 每孔加500 y 1油红0工作液，于室温下染色15分钟，然后 孔用1ml纯水洗3次至背景透明在倒驾显微镜下观察，可见 胞质中脂滴呈亮红色，照相记录然后每孔加入200 y 1 异丙醇，室温摇晃孵育15分钟进行抽提，取抽提液200liI放 入96孔板,于510nm读吸光度2.6.2细胞内的甘油三酯测定 吸弃48孔板各孔中的旧诱导 液后，用37C温育的PBS冲洗2〜3遍，加入适量的冰预冷的 RIPA裂解液后，置于冰上10〜20min。

用细胞刮刮下细胞后, 收集在EP管中后，用超声裂解仪裂解（100〜200w） 3s,共2 次低温高速离心（4C, 12000 g, 2min）取50u 1上清液, 使用考马斯亮蓝法进行蛋白定量其余上清液加入2倍体积的 甲醇氯仿混合萃取液（V/V=2： 1）,充分混匀进行萃取，静置 30min后，然后进行离心（4C, 12000 g, 2 min）,弃去上层 溶液，在70C条件下挥干下层溶液，然后加入20U1PBS,溶 解脂质，最后按照甘油三酯试剂盒说明书测定细胞内甘油三 酯2.7统计分析：所有实验数据采用均值土标准差表示利用SPSS软件 （10. 0版本）,对各组数据进行one-way ANOVA分析当P< 0.05时，则认为具有统计学意义3. 结果3. 1脂质堆积细胞模型的建立将细胞分为正常对照组（Con）、模型对照组（Model）和 阳性对照药组（Ber）,从实软结果看，模型对照Model组和 阳性对照药Ber组给以诱导液刺激48 h后，利用油红0 染色，显微镜下显示正常对照Con组细胞呈不规则多角型 和卵圆形，胞质中无明显亮红色脂滴模型对照Model组 细胞胞质中则广泛着色，被染上的亮红色脂滴多而大。

与 模型对照Model组细胞相比，小粲碱Ber处理的细胞内脂 质堆积程度明显降低，油红0染色的亮红色脂滴的体积减 小、数量减少定量的方法测定细胞内的脂积程 度结果显示，与正常对照Con组相比，模型对照Model 组的脂质沉积显著增加与模型对照Model组相比，小聚 碱治疗能显著减少细胞内的脂质堆积（图1）ConModelBerberineFigure I. Extensive lipid accumulation in HepG2 cells.Con= Normal control cell, Model= model control cell, Bei- cell treated with berberine. ###, P< 0.001 vs. Con. ***, F< 0.001 vs. Model3. 2肝细胞内甘油三酯水平的测定为了验证油红0实验的结果，我们同时测定了模型细 胞内11•油三酯的水平在诱导18 h后，收集细胞，裂解细 胞，并测定细胞内的甘油三酯水平结果显示，经过诱导 后，模型对照Model组细胞中的甘油三酯含量为正常对照 Con组细胞的3倍而在给予小联碱处理后，可明显减少 肝细胞中堆积的甘油三酯。

肝细胞中II.油三酯的变化与油 红0染色实验的结果一致（图2）6 5 4 3 2 10 nV o o o o o oFU5S8o+--8-6 -SLog(C] (mol/L)Figure 2. Intracellular triglyceride contentCon= normal control cell, Model= model control cell, Ber= cell treated with berberine, TG= triglyceride. Each value is expressed as mean SEM. ###, P <0.001 vs. Con. ***, P <0.001 vs. Model. 3. 3适合筛选药物的最佳诱导时间和最住诱导剂撬的选择分别观察了不同的诱导时间（12 h、24 h、48 h、72 h） 和不同的油酸浓度（1 mM, 0.5 mM）对肝细胞脂质堆积的影响 和对小果碱治疗作用的影响结果显示，12 h相比正常组细胞, 模型组细胞并无显著性差异，小聚碱组也无24h相比正常组 细胞，模型组细胞脂质堆积程度有显著的增加,小鬃碱能改善 脂质堆积。

48h, 72h,相比正常组细胞,模型组细胞脂质堆积 程度更为有显著的增加，而小聚碱下•降的程度更多分别采用 2种浓度的诱导液，采用5个剂揖，发现0. 5 mM时药物治疗空 间较小，易引起误差，脂质堆积程度无ImM的明显，选取lm\l 则更好综合考虑细胞内的脂质堆积程度和小果碱的作用强 度，1 mM油酸钠、50 nM胰岛索共同诱导18 h的实验条件 比较适合样品的筛选（图3）Response to ditferentTi me-cours oleic acid concentrationsFigure 3. Effects of berberine on intracellular lipid accumulation in HepG2 cells.Con= normal control cell, Model= model control cell, Ber= cell treated with berberine. ##, ###, PvO.Ol, 0.001 vs. Con. *, **, ***, 。