贻贝足粘蛋白研究报告进展.doc

贻贝足粘蛋白研究进展吕玉伟 王睿劼 王英娟＊ 〔西北大学生命科学学院;省生物技术重点实验室， 710069〕摘要 贻贝足粘蛋白是由贻贝类腹足附近的足腺合成并分泌到足丝的一类特殊的粘性蛋白质,能够在水下迅速固化形成具有粘附能力的附着基，具有生物降解的特性、生物相容性好，无毒、无害、无免疫原性，具有合成胶所不具有的特点，一直是粘合剂领域的研究热点目前对贻贝足粘蛋白的研究有很多，通过对现有文献的检索，概述了贻贝足粘蛋白质的氨基酸组成、构造、基因表达、获取方法、粘附机理及应用等方面的研究进展，为贻贝足粘蛋白的进一步研究提供参考资料关键词足粘蛋白；粘附机理；Mefp基因；多巴；获取方法中图Research progress of Mytilus Edulis Foot ProteinLV Yuwei ,WANG Ruijie ,WANG Yingjuan＊〔College of Life Sciences,Northwest University, *i’an 710069,China〕Abstract：Mytilusedulisfoot protein which is synthesised by Mussels foot gland can rapidly be solidified under water to attache with adhesive ability and it has the nature of biodegradation, biopatibility, nonto*ic , harmlessandno immunogenicity. In addition ,the nature do not have in synthetic rubber. Because its e*cellent adhesive bonding characteristics ,Mytilusedulisfoot protein has been a hot research field.The retrieval of the e*isting literature on the types of mussel adhesiveprotein, amino acid position and structure, genetic e*pression,adhesion mechanism and genetic engineering researchprovide scientific information for further study on mussel adhesiveprotein.Key words:Mefp ; Adhesion Mechanism ; Mefp gene; DOPA ; Gain贻贝是双壳类软体动物，俗称海虹和青口，可在水环境中结实地黏附于各种不同材料外表，其足丝中起黏附作用的物质已被证明是各种贻贝足粘蛋白。

贻贝足粘蛋白〔Mytilusedulis foot protein, Mefp〕是由贻贝类腹足附近的足腺合成并泌到足丝的一类特殊的粘性蛋白质，是足丝的主要成分，又称多酚蛋白质或贻贝粘附蛋白质[1-4]Mefp粘合强度高，能在水下迅速凝固成有黏附能力的附着基，呈生物惰性并具有生物降解的特性，生物相容性好，对人体无毒、无害、无免疫原性，具有合成胶水所不具有的特殊优势，可作为生物粘合剂广泛用于软组织黏接、人造骨骼断骨接合、口腔修复以及眼科手术等，有可能成为今后医用粘合剂研究的主流本文就目前国外Mefp的开发研究及临床应用概况作简要介绍 z.-1 Mefp的氨基酸组成及构造随着Mefp的氨基酸组成序列及构造的研究，已经知道Mefp分子量约为l30KD，为碱性多酚蛋白质，富含Pro/hyPro、Ser、Thr、Lys、Tyr、Ala以及多巴〔3,4-二羟基苯丙氨酸，DOPA〕，羟基化和氟基化后的脯氨酸残基有利于蛋白的正确折叠并且赋予粘蛋白更好的黏附性能[5]。

Mefp的一级构造由75-80个多肽片段重复构成，多肽片段类型有A、B、B'、C、D、E 6种其中，E型最为常见是十肽片段〔-Ala-Lys-Pro-Ser- Tyr-Hyp-Hyp-Thr-hyPhe-Lys-〕；B、C、D型与E型类似，均为十肽片段，差异仅在个别氨基酸残基，B型的第3和第5位分别为Hyp和hyPhe，C型的第5位则是hyPhe，D型的第3位为Hyp；A型、B'型不同于E型，为六肽片段，其中A型肽段为-Ala-Lys-Pro-Thr-hyPhe-Lys-，B'型肽段为-Ala-Lys-Pro-Thr-Tyr-Lys-，二者仅是第5位的氨基酸残基不同研究发现Mefp的糖基化和羟基化程度均非常高，肽链之间交联严密形成二级构造，其中富含hyPhe，构造异常复杂[6]2Mefp家族及主要家族的表达目前多以紫贻贝为材料开展Mefp研究紫贻贝中至少有8种足丝蛋白，分别为Mefp1~Mefp6、preCoID和preCoING，其中胶原蛋白preCoID和preCoING主要构成贻贝足丝蛋白的核心骨架并延伸至足丝盘[7]；Mefp-1分布于的整个足丝外表而构成足丝的保护外套，以防止海水的溶解及微生物的降解；Mefp2~Mefp6主要位于贻贝的足丝盘，是贻贝的足丝与外界固体外表形成黏附的主要成分。

随着对于Mefp家族的基因表达研究的升温，Gene*公司率先用贻贝酚腺中mRNA建立了蛋白质数据库，并鉴定出贻贝足蛋白质的氨基酸残基为十肽和六肽的交替排列形式该公司通过mRNA，创立多酚蛋白质的cDNA文库，构建大肠杆菌穿梭质粒,在酵母中进展Mefp的基因表达研究，证明重组外源基因Mefp可以在宿主中稳定、良好地表达出MefpMefp-1由80个E型十肽串联重复的组成，分子量约为108KD，是Mefp中最大的蛋白，主要分布在足丝和附着基外外表的涂层中，DOPA的含量约为11％，通过与苯醌发生交联反响和与Fe〔III〕发生金属络合反响，形成致密和坚韧的涂层，保护足丝的降解Mefp-1基因重组后，尝试在大肠杆菌、酵母体系中进展表达，但是由于Mefp-1自身的特性，大约80个串联的十肽重复序列导致质粒不稳定，从而影响翻译过程，在二宿主很难获得成功表达 Mefp-2的分子量为45KD，在Mefp中约含40％，含量最高，富含胱氨酸和DOPA〔约5%〕、含有11个串联的表皮生长因子〔EGF〕的重复单元，是附着基的主要成分，与粘蛋白之间的共价交联有关[8]利用Mefp-2基因构建转化载体，转化巴斯德毕赤酵母〔Pichiapastoris，Gs115〕，经过筛选阳性转化株后，通过与野生型比照的组氨酸检测及分子生物学PCR检测，获得Mefp-2基因重组酵母菌株Gs115/mefp21，重组菌株可以经过甲醇诱导和发酵培养[9]。

Mefp-3的分子量为5-7KD，无重复单元，在Mefp中含量最少,但DOPA的含量高达28%，主要分布在基底面和外界接触的界面处，含有Arg，Arg被修饰成4-羟基-L-精氨酸〔R〕后能以π-π键、库伦相互作用、H-键在金属外表形成有机金属络合物而粘到物体外表重组Mefp-3基因的A型基因Mefp-3A,，在大肠杆菌中表达出的Mefp-3A蛋白质分子量为7KD[2]，最近楠楠等[10]将Mefp-3基因转入到大肠杆菌，Mefp-3蛋白主要以包涵体的形式得到了表达Mefp-4的分子量约为90KD，有多种高度重复序列，富含有大量的His、Lys、Arg及Asp，其中His为22%，但DOPA的含量仅为2%与Mefp-2一样分布在附着基上，Mefp-4可能与足丝纤维中的胶原蛋白相连接，同时在足蛋白分子之间的交连发挥作用[11]尚未见到基因工程方面的研究资料Mefp-5的分子量为9KD，有76个氨基酸，每四个氨基酸中就会有超过1个的DOPA，总含量为30%与Mefp-3一样，Mefp-5分布于基底面和外界接触的界面处序列中超过1/3的残基经羟基化和磷酸化〔Ser〕修饰，具有强粘合力 Hwang等从cDNA中克隆的Mefp-5构建了含有His6、IPTG诱导启动子标签的大肠杆菌表达载体，借助原核表达系统成功表达得到重组Mefp-5蛋白质[12]。

Mefp-6的分子量为11.6KD，其中序列中含量最丰富的是Try(20%),其次是Gly(14%),Cys为〔11%〕，但DOPA的含量不到5%有1/3的Cys保存了自由的巯基，介导足丝盘和黏附蛋白中的DOPA之间形成交联构造，且发现了多种天然变异体[13]，鲜见其基因表达研究资料3 Mefp的获取方法天然的Mefp制成细胞或者组织培养用的粘合剂产品"Cell-Tak〞,主要是Mefp-1、Mefp-2和Mefp-3的混合物，可以使细胞或者组织粘附在塑料、玻璃、金属和各种生物材料等各种材料外表现阶段从天然贻贝中提取纯化Mefp是获得该粘合蛋白的主要途径，也是最直接的方法，但是由于贻贝足丝蛋白的分泌量极低，一万个贻贝仅能得到1mg的粘蛋白，所以价格昂贵有研究通过体外培养足腺细胞来制备粘蛋白，这样不仅能够制备高粘度的蛋白，而且也有利于研究分泌调控的机制，但是由于无脊椎动物细胞普遍存在培养难、本钱高等问题，目前足腺细胞的体外培养及建系尚未成功[14]研究者尝试利用基因工程的方法生产贻贝足粘蛋白，取得了一定的进展，但是不能完全解决Mefp来源难题大肠杆菌中表达出的重组蛋白质Mefp-3A，亲和层析纯化纯度达99%，产率为18%，在5%醋酸缓冲液中的溶解度好，粘性与已经商业化的贻贝粘蛋白质Cell-Tak相当[2]；借助大肠杆菌表达的重组蛋白Mefp-3，亲和层析后纯度约98%，但黏附性能仅为天然提取的一半[10]，可能是天然的粘蛋白在贻贝足腺细胞中被合成时经历了复杂的羟基化、磷酸化、糖基化及交联反响，与原核生物的修饰不同导致其粘附性差异。

原核表达的重组蛋白质Mefp-5，含量为40 mg/L，占可溶性总蛋白质的10%，亲和层析纯化后纯度可达95%，但由于其粘附于层析柱上，回收率仅为7%，而且重组Mefp-5基因表达后几小时，表达速率下降至几乎停顿，之后大肠杆菌细胞恢复生长，同时伴随着重组Mefp-5蛋白质的轻微降解[12]4 Mefp的粘附机理Mefp的粘附机理一直是贻贝粘蛋白的热点研究领域，目前认为Mefp的强粘合力与其氨基酸残基密切相关，其中最关键的是酪氨酸经羟基化修饰的DOPA残基，DOPA能与蛋白质等极性聚合物间形成很强的氢键，并且DOPA的苯酚基团有很强的金属络合力，可以在材料外表形成不可逆的有机金属络合物Qi Lin等[15]发现在云母的Mefp (Mefp-1&3)中含有10-20%的DOPA，对其的粘附力至关重要，除去粘附界面DOPA残基后，其粘着力显著下降[16-17]；在Mefp-5中DOPA的含量约占30%〔含量最高〕，拥有粘附能力到达Ead= ̴ -14mJ/m2，超过了任何一种相互作用的粘蛋白[18]研究认为Mefp-3和Mefp-5在水环境中能够保持较佳的粘附力，是因为DOPA中的酚羟基以供/受H体与金属外表形成形成氢键，强度远大于水与金属外表形成的氢键[19]，此外残基中磷酸化Ser的O-磷酸丝氨酸对钙的亲和力很强，与金属外表相接触时，磷酸基团的负电荷与金属离子相互作用，可以提高粘附性能[20]。

另外Mefp-1及Mefp-1中含DOPA的多肽，能与Fe3+在20℃、pH10的条件下形成稳定的三价铁络合物〔稳定常数超过1040〕，以此增强Mefp粘合力；此外DOPA残基与其他芳香基。