石蜡切片方法,木质材料软化方法,石蜡切片制作方法,kd202.docx

为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划石蜡切片方法,木质材料软化方法,石蜡切片制作方法,kd202　　微树芯石蜡切片前处理:固定及软化　　将取下的微树芯或者大块材料迅速放入新配置的FAA溶液中进行固定固定时间需要加长至1周左右，固定时间不能太久，否则FAA中的乙酸和甲醛可能会破坏细胞结构　　将固定后的微树芯或者用凿子采取的材料块切成包含3–5年木质部、形成层、韧皮部区域的小块，放入乙醇甘油(70%乙醇:甘油=1:1)中进行软化，软化时间应大于1周通过软化，可使材料变软，浸蜡后容易切片但甘油软化会使甘油长期存在于材料中而影响染色效果，因此相应增加染色时间,在番红溶液中的染色时间增加至3h　　微树芯石蜡切片制作　　脱水　　在低浓度乙醇溶液(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇)中的脱水时间以–h为宜,而在高浓度乙醇溶液(95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II)脱水时间应尽量控制在1h左右　　透明　　乙醇与石蜡互不相溶,用二甲苯作为媒介将脱水后组织中的乙醇置换出来,称为透明微树芯透明最适的时间为乙醇:二甲苯=1:1、二甲苯I、二甲苯II各1h。

　　浸蜡　　用石蜡取代透明剂,二甲苯浸入组织在切片时起支持作用称为浸蜡先用二甲苯:石蜡=1:1的混合液进行浸蜡,时间延长至48–72h　　浸蜡时温度应该控制在37℃左右,温度过高可能会使组织变脆而不易切片然后在高于石蜡熔点2℃下换成用纯石蜡浸蜡3次浸蜡完成后即可包埋　　切片　　将包埋好的蜡块用刀片修成规整的正方体或长方体,以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上,夹在轮转式切片机的蜡块钳内,使蜡块切面与切片刀刃平行,旋紧调整切片厚度为8–12μm,切出10–25cm蜡带后,用毛笔轻托轻放在光面纸或者玻璃板上　　切片过程中,如果材料是长形的,若横着切,由于受力面积较大,容易变成碎片或者只有石蜡而没有组织此时应该沿着材料竖着切,这样可以减少受力面积而收到较好的效果有时切下来的蜡片会卷在刀片上,这可能是静电作用的原因,只需在蜡块上沾点水即可　　粘片　　用粘附剂(采用蛋白甘油或明胶贴片剂)将展平的蜡片牢附于载玻片上,以免二者在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中滑脱开首先在洁净的载玻片上涂抹薄层粘片剂,直接滴两滴蒸馏水于载玻片上,再把蜡片放于水滴上,略加温使蜡片铺展,展片时温度不能过高,以免使石蜡融化。

最后用滤纸吸除多余水分,将载玻片放入37℃温箱　　中干燥24h即可进行染色　　染色-脱水-透明　　为了区分韧皮部、形成层区域、木质部区域等,采用复染的方法进行染色由于韧皮部、形成层及伸长细胞区域细胞壁较薄,没有木质化,染液容易着色和洗脱,而木质化区域的细胞壁较厚,着色的染液不容易洗涤出来,因此,可用复染的方法来区分厚度不同的细胞壁及木质化的程度常用的一些染料组合有亚甲基蓝-天青A(细胞壁木质化区域染成蓝绿色,细胞壁非木质化区域则染成紫红色)和番红-固绿(木质化区域细胞染成红色或者紫红色,非木质化细胞壁用固绿替换,染成蓝绿色)　　以番红固绿染色法(l%番红-水溶液,%固绿-95%乙醇溶液)为例:首先用二甲苯脱蜡12min,然后依次经无水乙醇、不同浓度的乙醇、蒸馏水进行逐级复水后放入番红溶液中染色3–5h,进而经不同浓度的乙醇溶液逐级脱水至85%乙醇后,在固绿中染色30s木质化细胞被染成紫红色,非木质化区域(伸长细胞、形成层和韧皮部)被染成蓝绿色,区别较清楚此外,材质较硬的阔叶树红桦,油脂含量较高的油松,以及青海云杉、青杄等石蜡切片，可以看出细胞形态正常,各部分对比明显染色后经二甲苯透明,用中性树胶或加拿大树胶进行封片,烤片后保存。

　　染色时间的控制尤为重要在用番红染色3–5h后,由于全部细胞被番红染成红色,需不同浓度的乙醇溶液洗掉薄壁细胞区域的番红,然后在固绿中进行复染因此,控制好逐级洗脱番红的时间非常　　重要,时间过长会把木质化细胞壁中的番红也洗出,最终包括木质部全部染成绿色,时间太短又不能洗出韧皮部及形成层区域的染料从而全部染成紫红色根据对祁连圆柏微树芯染色的实践经验,逐级脱水的时间为1min,固绿染色时间为30s　　对传统的植物石蜡切片制作方法的改进主要包括：(1)将固定液的体积由材料的20倍以上增加至50倍以上,固定时间延长至一周以上;(2)增加蛋白甘油软化步骤,使含木质部的微树芯更容易切片;(3)确定了微树芯组织脱水、透明以及浸蜡各步骤的时间;(4)对微树芯番红-固绿染色的步骤及时间也进行了调整,同时去掉铁矾及苏木精染色的步骤,对微树芯染色效果更佳通过对常规方法的改进,能够做出完整的高质量的微树芯石蜡切片　　浅谈石蜡切片的制作与存在问题　　摘要:石蜡切片是观察植物组织构造常用的制片方法之一活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,观察植物叶片结构结果显示，组织经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤后完好保存细胞原有状态，而且能清晰辨认其形态结构。

　　关键词：石蜡切片；组织；染色；形态结构　　石蜡切片(paraffinsection)石蜡制片又叫永久制片,组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法其优点主要是适合各种植物组织的制片,切片的厚薄易于控制(最薄可达015μm),清晰度很好,亦适合作细胞学研究,并能够制成连续切片,制片易于长久保存,易于交流等但制片周期较长,易受条件限制,制片中使用化学试剂较多,对人有一定毒害,易使材料变脆、变硬或变形,某些内含物易于消失,常使组织变小,甚至使组织扭转变形,细胞所含物质缩小而折光性增强,影响观察正确性,且制片成本较高等　　一、植物组织制片技术的概述　　植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，使人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分[1]切片技术是生物科学工作者特别是植物学工作者常用的一种实验手段随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用，石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中，做为基础技术提供有效的实验或使用样品石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中，可对材料中被杂交的DNA分子进行定位、含量分析或观察基因表达水平；聚合酶链式反应技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA分析，使研究进入了分子水平，但在短期内这些技术尚不能做常规使用[2]。

迄今为止,植物制片技术已建立了许多方法，多采用的有徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡切片法等[3]，其中最常规的为石蜡切片法然而采用常规石蜡切片法包埋及染色所需的时间太长、太繁琐，有些质地过硬的材料也不宜使用本研究同样采用此方法，并在方法上进行了一些改进，其周期短成为该法的显著特点，8-10天即可完成整个制片过程，同时还节省了试剂[6]　　二、实验器具与试剂　　2．1器具　　石蜡切片机、烘箱、切片刀、恒温展片台、蜡杯、酒盅若干、酒精灯、蜡铲、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、台木、树胶、脸盆、包埋纸盒、吸管、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等　　2．2试剂　　1%番红、1%固绿、各浓度的酒精、FAA固定液、二甲苯、石蜡、埃利希苏木精染液、郝普特氏粘片剂、蒸馏水、中性树胶等　　3实验材料　　选择植物健康、标准、具代表性的部分[4]如果不是为了特别目的，不能用一些病态的不正常的材料采下的材料应尽快浸入固定液固定本实验采用几种针茅的叶片进行石蜡制片，材料直径1mm左右，长4实验步骤　　4．1固定　　所截取得材料应迅速投入固定液选择固定液的原则就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。

良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色因此植物材料不同，应选择不同的固定液我们选择FAA固定液对针茅叶片进行固定，FAA固定液是最常用的一种固定液，其用量最少应为所固定材料的总体积的20倍，应该使植物材料四周都能浸泡在固定液里，这样能在短时间里使固定液浸透材料植物材料固定后，若不立即制片，可以保存在固定液中，或转至70%酒精溶液中保存[7]　　4．2脱水及透明　　将材料从固定液中取出后，进行植物材料脱水，其具体流程如下：　　A：酒精X：二甲苯　　70%A→70%A(2h)→70%A→80%A→85%A→95%A+伊红→100%A→100%A→1/2A+1/2X→1/2A+1/2X→X→X设置浓度梯度是为了防止材料皱缩，但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定，对于幼嫩的材料，梯度要大些，各步浸泡时间可短些，　　老的硬的梯度则要小些，各步浸泡时间则相应要长些第二次100％A脱水很关键，一定要确保水脱尽　　4．3渗蜡　　将透明的材料用镊子取出放进蜡杯中，再把碎石蜡用蜡铲放到蜡杯2/3为止，加盖放入37℃温箱，放置24h进行溶蜡。

24小时后去掉蜡杯的盖子，之后再将温箱温度调至56℃放置5天，使其透明剂充分挥发取若干个酒盅将材料转移至盛有熔点为60-62℃石蜡的酒盅里，温箱温度调到70℃，2h换一次熔点60-62℃的石蜡，换三次即可进入包埋程序　　包埋　　折包埋纸盒　　包埋前应先准备包埋用的纸盒纸盒用较硬而光滑的纸折成，大小根据植物材料的大小而定，这里用6cm×1cm×1cm的纸盒　　植物材料包埋　　将纯石蜡倒入小纸盒，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直，进行包埋[5]稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固在常规石蜡包埋中最困难的是碎小组织、纤细叶片的包埋，可以在纸盒里倒入少许的石蜡，是材料基部固定住后，再倒石蜡至完全覆盖住材料　　修蜡　　将包埋好的材料从摆卖纸盒里拖出蜡块，用双面刀片切割成小块，刀片不宜太厚，以免材料从蜡块中脱落每个小块包含一个材料，并修成梯形，切面在梯形的上部注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热的蜡铲将其固定在木台上，植物材料的切面与木台的粘贴面平行　　切片　　将粘有蜡块的小木块至于切片机上固定，调整切距到适当大小，转动调节器调切片厚度8μm进行切片注意切片时要一手转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。

切片过程中，如果蜡带偏向一边，也要及时修正蜡块，从而保证切片的连续性　　粘片及烘片　　滴一滴粘片剂于干净载玻片中央，用干净的擦镜纸涂抹均匀后，滴上蒸馏水，　　将取下的具代表性的蜡带切成小段置于载玻片上，然后将载玻片放到恒温展片台上(保持40℃)烫片待充分烫平后将其移至边缘试玻片上的水分充分烘干之后将切片放置15天自然晾干或取代为31℃温箱烘干一天烫片时要注意把握时间，不能烫片过度，但要保证充分烫平　　脱蜡及染色　　将玻片标本放于切片框里待进行脱蜡于染色步骤，具体步骤如过一下)→85%A(过一下)→50%A→30%A→50%A+HCI→95%A+氨水→1%固绿(30s)→95%A(1min)→100%A(过一下)→100%A(过一下）→50%X+50%A(过一下)→100%X(过一下)→100%X(过一下)注意番红染色时间要长些，随后的两次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红，固绿的染色时间大约在20-30s，均要视具体情况而定　　封片　　从二甲苯中取出然好色的片子，用中性树胶进行封片酱油植物切片的玻片平置于实验台上，在上面滴一滴树胶于玻片中央位置，使其慢慢向外溢，用镊子取干燥的或浸在75%乙醇中的盖玻片，从植物切片的一侧呈一倾斜的角度接触树胶，慢慢盖上，待整个盖玻片的内表面全部接触树胶后，用镊子轻轻盖压玻片，赶出切。