合浦珠母贝遗传选育及两种免疫基因分析.docx

a·『a--··---11i-J-;liti--!tlif-e．㈨III I I III II U III l U III|Y1 9470 1 0上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我遵守学术道德，崇尚严谨学风所呈交的学位论 文，是本人在导师的指引下，独立进行研究工作所获得的成果除文 中已经明确注明和引用的内容外，本论文不涉及任何其她个人或集体● 已经刊登或撰写过的作品及成果的内容论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律成果由本人承当’! ’学位论文仨者签名：鲥伽闩期：乞如，年 多月 ，，2 FI I上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全理解学校有关保存、使用学位论文的规定，●批准学校保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，容许论文被查阅或借阅本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的所有或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印， 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文保密 口 ，在 年解密后合用本版权二}5靴论姗者学名：锹佣 坛本学位论文属于●f t期：扣年Z月店日J 冀币L1 签训 名# 、p力.，'•上海海洋大学研究生学位论文 答辩委员会成员名单姓名 工作单位 职称 备注●穗怠厶 上涵≯毛》蕃文≥ 存矿￡． 主席撇 ≥土别 L／髟 ∥ 承报 委员麦【夏￡ 鳞物彀堋 移蝮 委员-委员 委员 委员● 委员考瞄 L枷奶于确钢 影 鲫岩多、 秘书答辩地点 南海水产研究所 答辩日期 20 1 1．6．1 2●•••合浦珠母贝遗传选育及免疫基因研究 摘要●合浦珠母贝(Pinctadafucata)又称马氏珠母贝，是世界上哺育海水珍珠的丰耍种类之一，在国内重要分布于广东、广西、海南及台湾省沿海，国内合浦珠母 贝所产珍珠即为国际上享誉盛名的“南珠”。

海水珍珠养殖产业是国内华南沿海 地区的特色经济支柱产jlk之一近年来，南于海区污染、养殖病害频发和种质资 源衰退，致使养殖合浦珠母贝浮现了死产率高、生长缓慢等现象，导致了巨大的 经济损欠，成为制约海水珍珠养殖产业可持续发展的技术瓶颈之一因此，急需 开展合浦珠母贝遗传选育和分子免疫调控机制研究，哺育具有优良性状的新品种，发展新的免疫防治方略，增进合浦珠母贝养殖产业的健康发展 本研究在前期选育的基本上，以F3代不同壳色品系合浦珠母贝为亲本，构建了F4代不同壳色选育家系，运用伞同胞家系评价了生长性状的遗传力水平；筛选克隆了合浦珠母贝过氧化氢酶(Catalase，PoCAT)和抗菌肽theromacin●(antimicrobial peptides，PoAP)基冈，研究了其组织体现和调控模式，检测了重组抗菌肽的抗菌活性，证明了其对革兰氏阴性菌具有强烈的抑菌作用，而对革兰氏阳性菌无抑菌作用具体成果如下：1、合浦珠母贝壳色家系的建立及生长性状的比较 采用雌雄单个配对，成功建立合浦珠母贝壳色全同胞家系20个对其6个月龄的生长性状进行了比较，成果表白，BSF4．3、RSF4．1、RSF4．2和RSF4．5具 有明显的生长优势，可作为进一步定向哺育生长迅速、个体大的合浦珠母贝的材 料。

壳宽系数的比较发现，BSF4．3壳宽系数最大，RSF4．5、WSF4．2、WSF4．3 则次之RSF4—1与RSF4．2相对较低对不同壳色选系生长比较发现红色选系和 黑色选系存在明显的生长优势，明显性不小于其她壳色选系另一方面为金色选系，而● 白色选系的生长最慢2、合浦珠母贝幼体生长性状的遗传力及其有关性分析 以海南陵水新村港养殖的金壳(Gp)、黑壳(Bp)、白壳(Wp)和红壳(Rp)合浦珠母贝不同壳色选育群体为亲贝，采用雌雄单个配对和人工授精的措施，获得金壳家系4个，黑壳家系5个，白壳和红壳家系各3个分别在受精后5天、15天、•••25天和40天，从各个家系中随机取样50个幼体，测量其壳长及壳高，运用方差分 析比较壳色系的牛长差别同步运用非求导约束最大似然法(DF．REML)，对合浦 珠母贝在5、15、25、40日龄下的壳长和壳高性状进行遗传参数的估计成果表白， 实验期间，4种壳色系的平均壳长和壳高均存在明显性差别(∥0．05)，40个同龄下，● 白色选系均具有最大壳长及壳高，金色选系均存在最小壳长和壳高5"--40日龄幼 体壳高狭义遗传力估计值为0．17"-0．23，壳长狭义遗传力估计值为0．12"-0．22。

合 浦珠母贝幼体不同生长时期壳高和壳长的遗传有关和表型有关均为正有关，有关 系数的范畴分别为0．825"--0．989，0．832一,0．965，表白以壳i苗或壳长为参数进行选育时，均可达到改良生长性状的效果3、合浦珠母贝过氧化氢酶基因特性和体现分析过氧化氢酶(Catalase)是机体内一类重要的抗氧化酶，能保护细胞免受活性 氧的破坏，在牛物体抗氧化能力以及免疫防御方面起到重要作用本文研究了合 浦珠母贝过氧化氢酶基因构造特性和在应激状态下的体现调控机制，合浦珠母贝 过氧化氢酶基因PoCAT的cDNA序列全长为2428bp，其中5'-UTR为140 bp，● 3"-UTR为749 bp，ORF为1539 bp，可编码512个氨基酸，分子量大概为58．05 kDa，等电点为8．4序列分析显示，在3'-UTR区含3个RNA不稳定信号构造域(ATTTA) 和一种位于polyA上游l 8 bp处的加尾信号AATAAA预测的氨基酸序列不含信号肽，阐明该蛋白也许为胞内蛋白PoCAT中存在CAT家族的签名序列350RLFSYSDT358，活性位点序列60FNRERIPERVVHAKGAGA7s、12个NADPH潜在的结合位点(N145，H19l，F95，S吣R2∞，N2lo'Y212，K234，1299，W3∞，H302，Y355)、两个N糖基化位点N436ys439、N47SFS4SO以及三个催化位点Hie2，AsnⅢ和Tyr3SS。

运用MatGAT 软件对PoCAT氨基酸序列和其他物种CAT序列进行同源性和相似性分析，成果 表白PoCAT与其他物利-CAT序列具有较高的保守性，同源性为62．30／／0-82．2％，相似性为73％．92％组织体现模式分析表白PoCAT mRNA在消化腺、鳃、性腺、 肠和外套膜中均有体现免疫应激实验成果显示，在2 h、4 h和12h时PoCAT 基因在肠中的体现明显上调，表白PoCAT也许参与了合浦珠母贝的先天免疫应答●反映4、合浦珠母贝抗菌肽theromacin的基因克隆及原核体现 抗菌肽是生物体产生的一类多肽，具有分子量小，热稳定，水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广等特点，对真菌、细菌等病原微生物具有克制或杀灭作用，一般被 称为“第二防御体系”Theromacin是一类已被证明有抗微生物作用的抗菌肽，Il•••在机体的免疫系统中起着重要的作用合浦珠母贝的抗菌肽theromacin基因(PoAP) 全长522 bp，其中5'-UTR为6bp，3'-UTR为141 bp，ORF为375 bp，可编码124 个氨基酸，分子量大概为13．67 kDa，等电点为9．25序列分析显示，在3'-UTR区含1个RNA不稳定信号构造域(ATTTA)和位于polyA上游18 bp处的一种典● 型的polyA加尾信号AATAAA。

推导的多肽涉及信号肽和成熟肽两个部分，根据 SignalP 3．0软件推断卅信号肽的切割位点在Gla33和Trp34之间，产生具有 33个氨基酸的信号肽：预测成熟肽分子量为9889．4D，等电点Ip9．14，具有12个 Cys构造，13个碱性氨基酸残基Arg和Lys经TMpred软件分析出PoAP 存在一种跨膜螺旋构造，在Vall3到Ser34之间，表白PoAP是一种跨膜蛋白利 用MatGAT软件对PoAP氨基酸序列与其他己知theromacin序列分析显示PoAPtheromacin与其他已知theromacin序列的相似性为29．叫6．8％构建进化树成果，显示PoAP与其她物种的theromacin聚类到一起将该基因定向克隆到原核体现 载体pET-32aqb，在大肠杆菌BL2l中成功体现出带His．tag的融合蛋白，分子量 约为3l kDa，人小与预期一致对重组蛋F1进行纯化，并运用纯化的蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果进行了比较成果表白，合浦珠母贝● theromacin蛋白对革兰氏阴性菌存在明显的溶菌效果，而对革兰氏阳性菌没有抑 菌活性这阐明合浦珠母贝抗菌肽theromacin对病原微生物的抗菌作用存在选择 性。

核心词：合浦珠母贝，家系，生长性状，壳色选系，遗传力，过氧化物酶，抗菌肽， 基凶克隆，体现分析，蛋白纯化，抑菌活性●III•••Pearl oyster Pinctadafucata iS distributed over coastal area of South China and iS the most popular farming shellfish for seawater pearl production．However,since the mid一1 990s，pearl oyster begins tO die largely in China and leads to a dramatic decline in South China Seawater pearl production．Although it is still unclear about the causes for pearl oyster high mortality,it is believed 。