【2017年整理】液相色谱--比例阀及混合.docx

对于一个梯度洗脱液相而言，所有性能中最重要的其实是系统能否产生精确的线性梯度因此对系统进行足够详细的梯度验证测试是十分必要的这是个简单的测试，你需要一瓶HPLC 级的纯水放在 A 瓶中和含 0.1%丙酮的纯水放在 B 瓶中然后取下色谱柱，用一节细管子代替连接到色谱系统中，流速设置为 2mL/min 以产生足够的背压使单向阀能可靠地工作，最后将检测器的检测波长设置为 265nm如果是双元泵的高压混合系统，只需做两个测试第一，以 10%增量（0%B，10%B，…，100%B）测试，每个比例保持 3min，中间额外插入 45%B 和 55%B 两个比例实际值应在理论值的 1%范围内（标准可自由定义） 第二，设置一个 15min 的梯度变化（0%B-100%B） 结果应是一条直线如果是低压混合系统，需要加上一个测试以验证各通道的性能做法是将 A、B 连接至A 瓶，C、D 连接至 B 瓶然后以 50:50AB - 90:10AC - 50:50AB - 90:10AD - 50:50AB -90:10BC -50:50AB - 90:10BD - 50:50AB 走梯度，每个梯度保持 2min一个良好的四元比例阀最后应得到四个高度相近的矩形峰，每个高度相对于平均值偏差应在 1%以内（这个标准是自由定义的） 。

从第二个测试，即梯度线性测试，我们可以很简单地计算系统的死体积即是找到结果中 50:50AB 混合比例的时间，减去整个梯度线性变化总时间的一半（7.5min ） ，再以结果乘上流速即可知道系统的死体积了解了比例阀的测试方法，接下来应该对比例阀本身有一个简单的认识比例阀在 Waters2695 中称为“梯度比例阀”（Gradient Proportioning Valve，GPV） ，水平放置于溶剂托盘中，如下图： 在 Agilent 1100 中称为“多元梯度阀”（Multi-Channel Gradient Valve，MCGV） ，垂直放置于 G1311 四元泵中，位置如下：由于垂直放置，在使用缓冲盐时，建议将水相（含缓冲盐）置于下面的两个通道中（通常为 A 和 D 通道） 其造型和内部结构如下： AGILENT 的比例阀使用红宝石配合两个弹簧用于通道的密封在不通电时，电磁阀内的弹簧较为强劲，将红包石压在阀座上，通道关闭；当通电时，磁体被磁场往下吸，阀座下面的小弹簧则把红宝石和顶开，通道打开Waters 的比例阀的关闭和打开则使用一体式的设计，其电磁阀阀芯、隔开电磁阀和GPV 阀体的薄膜以及密封通道的堵头被固定在一起。

在不通电时，电磁阀内的弹簧将堵头压在通道的小孔上，通道关闭；当通电时，堵头和阀芯一起向后运动，通道打开Waters 和 AGILENT 的四元比例阀都属于常闭式设计，在不通电时通道关闭通过以上设计即可理解为什么 AGILENT 的比例阀故障率较 Waters 的高四元比例阀的比例控制方式基本都是相同的，即在一个柱塞杆的冲程内，根据方法条件分配各个通道的打开时间比如 A 相和 B 相按 60：40 的比例混合，则在一个柱塞杆冲程的时间内 60%的时间 A 通道打开，40%时间 B 通道打开由于比例阀的打开和关闭都有一个最小时间间隔（5ms 或者更多） ，所以事实上一些极低的比例（比如 0.5%）是无法达到或稳定维持的二元泵的梯度方式并不是通过比例阀进行控制，也不是通过溶剂选择阀（Solvent Selection Valve，SSV ） ，而是通过控制两个泵的流速来实现比例控制在二元泵中没有比例阀，而 SSV 其实属于选配，SSV 的作用是允许使用者从四种流动相中选取 2 种运行色谱条件，主要是便于序列运行多种色谱条件时流动相的切换比如系统流速设定为1mL/min，A 与 B 以 60：40 混合，则 A 泵将以 0.6mL/min 的速度输送 A 相，B 泵将以0.4mL/min 的速度输送 B 相。

当然实际情况可能会考虑到溶剂混合和溶剂压缩性能而变化我们可以看到溶剂虽然是按照设计的比例被抽取的，但并不是以设计的比例混合后抽取的，所以在之后的管路中，流动相的混合是一个非常重要的，混合效果会直接影响梯度洗脱保留时间的重现性以及基线噪音对于 Waters2695，流动相的混合主要发生在两部分，一个是比例阀到柱子之前的所有连接管道，一个是泵内高压混合对于泵内混合，我个人认为初级泵中的“预压缩” （在泵中会解释）步骤贡献最大试想液体在初级泵中体积被压缩至原来的 5/6 左右，这能带来怎样的混合效果？当然之后的管道也能带来并维持一定的混合效果对于 AGILENT 四元泵系统，流动相从 MCGV 到泵再到 Damper（阻尼器，同时有测量系统压力的作用）再经过自动进样器再到达色谱柱而其二元泵系统相比四元泵，又额外多了一个混合器无论是 Damper 还是混合器，其目的都是为了更好的混合效果，虽然这些都增大了系统体积至于为什么二元泵还额外需要一个混合器，可以留在泵中讨论当然也希望有朋友能先提出自己的见解，毕竟我的也只是一家之言关于混合效果的测试实验，我找到一个资料，自己没做过，希望有朋友测试一下，然后反馈过来。

实验条件如下：一根 C18 色谱柱，流动相 A 为含 0.1%TFA 的水，流动相 B 为含0.1%TFA 的乙腈，B 在 35min 内从 5%变化到 40% ，流速为 1mL/min，样品为 10uL 水，在 214nm 波长下采集数据，查看基线波动情况当然理论上要求采用同样的检测器，这对仪器有一定的混搭要求，不过从该资料提供的结果上看，混合不好的话，在 B 比例比较低的时候基线噪音会比较大，然后慢慢好起来关于混合，静态混合器实际内部结构应该是多通道多截面，使流动相在静态混合器内充分混合，这样对紫外吸收敏感的溶剂而言，必然可以降低因混合不均儿造成的基线噪音问题。