TakaraRNA提取试剂盒9767说明书.doc

研究用TaKaRaTaKaRa MiniBEST UniversalRNA Extraction Kit说明书目录内容 页码•制品说明 I 1•制品内容 1•保存与运输 1•预防RNase污染的注意事项 2•使用前的注意事项 2•不同组织的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量 2•试剂盒操作流程简图 3•操作方法 3•实验例 7•不同组织的RNA提取量 8•附注 ■ I ■ ww $•Q&A 9•制品说明本试剂盒是用于提取培养细胞及动物组织、植物组织（權物幼嫩的叶.茎等）（Cultured cells/Animal Tissue/Plant Tissue ）等RNA的广语型小■钝化试剂盒试剂盒采用了独特的细胞裂解系统，无需苯酚 氯仿抽提等步骤,简单快技组织或细胞通过勻浆裂解或液氮研詹后在裂解液中释放核酸•裂解液分别 经过gDNA Eraser Spin Column （去除葛因组DNA ）以及RNA Spin Column （结合RNA）.从而达到 提取高质fiRNA的目的本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，组织或细胞裂解后•提取操作仅濡20分钟便可完成利用该试 剂盒提取的RNA純度高,基本不含戋白质及基因组DNA污轧 使用本试剂盒可从1.0E+05-1.0E+07 培养细胞、5-40 mg动物组织或50-100 mg植物组奴中腕化得到多至数+微克的高鈍度RNA。

提取 得到的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交.mRNA純化.体外18译、RNA分解BB的保护分 析、RT-PCR. Real Time RT^CR.构M cDNA文阵等各种分子生物学实验利月本试剂盒中的gDNA Eraser Spin Column （去除基因组DNA ）可以进行简单的萬因组DNA提取 提取的DNA可以用于PCR反应尊分子生物学实验-*1有关墓因组DNA的提取请步考附注•制品内容（50次虽） 本试剂盒分为Part I和Part II两部分■ Part I ・2（TC保存50xDTT SolutionRecombinant DNase I (RNase-free ; 5 U/pl) 伽 DNase I Buffer700 pl1,000 U1 mlPart II 室温(15°C*25°C )下保存Buffer RL*232 mlBuffer RWA・228 mlBuffer RWB・330 mlRNase Free dH2O15 mlgDNA Eraser Spin Column50支RNA Spin Column50套Collection Tube ( 2 ml)50支RNase Free Collection Tube ( 1.5 ml)50支•2含有强变性剂，应避免与皮肤.衣物等接绘。

若不小心接融到眼睛或皮肤时， 请立即到医院进行处理3首次便用前.向Buffer RWB中添加70 ml的100%乙H试剂盒之外所需准备试剂】•无水乙醇• 70%乙醇（0.1% DEPC处理水配制）♦ PBS Buffer•保存与运输1. 本试剂盒中的Part I请于・20°C保存和运输2. 本试剂盒中的Part IIW于室温（15°C-25°C ）下保存和运输•预防RNase污染的注意事项RNA制备的关健是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器真及试剂中的RNA分解胡的污染因此， 在实验中必须采取以下描施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中邂免讲话等 等通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解晦的污染•使用器具尽■使用一次性塑料器皿.若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理⑴用0.1% DEPC （焦碳酸二乙酯）水溶液在379下处理12小时⑵然后在1209下高压灭菌30分钟以除去殘留的DEPCoRNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实脸♦试剂配制月于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180°C , 60分仲）或便用上述方法进行DEPC水处理灭菌 后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC 处理后再进行高溥离压灭菌。

RNA实脸用的谊剂和无菌水祁应专用•避免混用后交叉污染°•使用前的注意事项♦ Buffer RL若出现沉淀t请于609加热溶解，待恢复至室温后使用♦操作前请在Buffer RL中加入502TT Solution至终浓度为2% （即毎1 ml的Buffer RL中加入20 pl 的50xDTT Solutiono此裂解Buffer最好现用现配加入50xDTT Solution的Buffer RL可在室温放 置1个月♦ Buffer RWB在苜次使用前，请添加70 ml的100%乙B9 ■混合均勻♦ gDNA Eraser Spin Column以及RNA Spin Column的量大容积为600 pl ,使用时如果液体的体积超 岀最大容积，请分批加入•以下实验操作t如无转殊说明,均在室温进行•不同组织的最佳起始试和裂解Buffer RL使用丘组奴或细胞的起姑量对RNA的提取效果有很大影响若组织的起始■过多.RNA的质■和相对收■都 会有所降低一般来说，使用该仗剂盒能够对1.0E+05-1.0E+07培养细胞、5-40 mg冻存或新鲜的 动物组块、50-100 mg冻存或新鲜的權物组织进行RNA的提取。

培养细胞的最佳起始■［为1.0E+06 , 动物组块的最佳起始量为10 mg ,植物姐织的最佳起始■为50 mg.对于gDNA含屋较高的组块（如脾 脏、肾脏尊）应减少起始量,对于植物组织（植物的茎.根等）以及较难裂解的动物组织（如肺.心脏 尊）.除应当降低样品的起始豎外，还血当加大製解Buffer RL （使用爾需加入终浓展为2%的502TT Solution的用丄 在实验之前,请爹考Table 1中不同组织的最佳起始畳和裂解Buffer RL的使用■<>样品起嬢凤裂解Buffer RL的最佳使用;1贴壁培养细胞（培养AD直径<6 cm ）350 pl贴壁培养细胞（培养皿直径6-10 cm ）600 pl<5x10«的杲浮培养细胞350 pl5x10®-1x107悬浮培养细胞600 pl5-20 mg#通动物组妃（脑、肝脏等）350 pl20-40 mg普通动物组块（脑.肝脏等）600 pl5 ~ 20 mg特殊组织（肺、脅脏、脾等）350 pl20-40 mg特殊组织（肺■肾駄脾等）600 pl50-100 mg植物组织（叶片、茎）500 plTable 1不同组织的最佳起始■和裂解Buffer RL的使用■•试刊盒操作流程简图•操作方法动韧培芥堆話的RNA提取1. 细庖的SMe◎浮培芥的动精细胞裂霹:① 将◎浮培养iffl甌同塔芥液一圮債入事心玄中.&000 g 4^C«心2分管.弃上② 使用1xPBS蕭洗一次.8,000 g 4°C宿心2分仲.弃上看■向收集的细庖中加入岳当■ （ Table 1中推荐的使用■）的裂解Buffer RL （使用前■勵认已加 入 5O*DTT Solution ） ■③ 使用移液枪反貫吹吸直至般解液中无明显沉淀。

貼呈培养细胞的*解：① 倒出培养浚.使用仆PBS清洗一次② 向培养细胞中DO入乞当■ （ Table 1中推荐的使用■）的毂解Buffer RL （使用前请确认已加入 50xDTT Solution ）,水平放■片甸・均勻分布于Ifl■表面并RMlflU ,然后使用移 液枪吹打缎胞使其悅落（对于贴It牢固的培养细胞可用细胞刮勺剧妄细胞）•③ 辖内含细胞的脱解液转移至妄心管中.用移液枪反复吹吸直至裂解浚中无明显沉淀.2. 裂解液室温静■ 2分榊.3. 小心吸取朝第液到新的1.5 ml RNase Free Tube中.注：对于基因组含■较多的材料或看材料起始■较大时.可以直接帔步嫁8进行（否IM DNA含■过高 可能造成gDNA Eraser Spin Column堵基）.如基因组含■较低或材料起始■较少时.可以按步 黑4・7进行.4. 将 gDNA Eraser Spin Column 安放刘 2 ml 的 Colloctlon Tube （试捌金提供）上.5. 将U第液转移入到gDNA Eraser Spin Column中.6. 12.000 rpm ,枣心 1 分禅.7. 弃gDNA Eraser Spin Column （进行墓因组DNA提取时请保留）•保留2 ml Tube中的滤滾。

8. 向上述步鼻3或步環7中加入与浚体尊体积的70%乙亟（it时可能会出現況淀）.使用移液枪将 S«S合均勻•9. 立即辖混合液（食沉淀）全部转入到RNA Spin Column （含2 ml Collection Tub© ）中如果混 合滾的体积大于600 pl .请分批加入.毎次加入的体积不工大于600 pU ）10. 12,000 rpm .夜心 1 分仲，弃浊｝#•捋 RNA Spin Column 放回到 2 ml Collection Tube 中.11. 将 500 pl 的 Buffer RWA 加入至 RNA Spin Column 中 t 12.000 rpm 宙心 30 秒钟•奔滤液12. 将600训的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中f 12.000 rpm宙心30秒钟，弃滤憑 注）遗确认Buffer RWB中已经加入了播定体积的100%乙諄请沿RNA Spin Column管童四周加入Buffer RWB .这样有助于完全冲洗沾附于竇莹上的盐份.13. DNase I消化（可选择）：利用本试刑盒中的gDNA Eraser Spin Column以及RNA Spin Column可取有效地去除培养细胞中 绝大部分的墓因组DNA・提取的RNA -般不含E因组DNA。

若后续实・对RNA郭度要求比较严 格.可以选择性堆在RNA Spin Column 88上进行DNase I消攸① DNase I 反应液的配制：取 5 pl 10覧DNase I Buffer . 4 pi Recombinant DNase I （RNase free v S U/pl ） , 41 pl RNase free dhUO 到新的 1.5 ml RNase Free Tube 中.混合均勻•② 向RNA Spin Column朕中央加入50 pl DNase I反应液t空温紳H 15分钟.③ 向RNA Spin Column朕中央加入350训的Buffer RWB , 12.000 rpm离心30秒艸.弃建 液14. 重复操作步W12<15. 将 RNA Spin Column 倉新安氏于 2 ml Collection Tube 上.12,000 rpm 宙心 2 分铸.18.将 RNA Spin Column 安｛■于 1.5 ml 的 RNase Free Collection Tube （试剂盒提供）上■在 RNA Spin Column IR中央处加入 50- 200 pl 的 RNase Free dHQ 或 0.1% DEPC 处理水.空温静H 5 分祝17. 12.000 rpm復心2分钟洗脱RN入若提高 RNA 的收■.可再向 RNA Spin Column 。