实验四 动物血液中DNA的提取-教案.doc

授课教师 常祖明 学生人数 55 课 题 血液基因组DNA的提取 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学用具 多媒体、实验室设备 教学目的 掌握鸡血DNA提取的原理及方法 教学重点 理解实验过程中每一步操作的目的及原理 教学难点 教学过程一、实验目的1.掌握鸡血DNA提取的原理；2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。

二、实验原理哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA禽类的血细胞则可以禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体且材料易得、经济用鸡血细胞做实验材料有两个原因一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长三、实验仪器1.水浴锅：55℃2.离心机：8000转、12000转3.离心管：5ml（120个）4.移液枪：10μl、680μl、700μl、800μl 、900μl 、1ml5.容量瓶：100ml6.取血针及管四、实验材料及药品实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136ml）1.无水乙醇作用：DNA沉淀剂、洗涤剂商品信息：瓶/500ml，分析纯AR理化性质：无色澄清液体有灼烧味极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶储存：储存于阴凉、通风的库房远离火种、热源库温不宜超过30℃保持容器密封应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储采用防爆型照明、通风设施禁止使用易产生火花的机械设备和工具。

危害：易燃，具刺激性蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）2.柠檬酸作用：ACD抗凝血剂成分之一在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇在潮湿的空气中微有潮解性储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用柠檬酸可燃粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险3.柠檬酸钠作用：ACD抗凝血剂成分之一能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固商品信息：柠檬酸三钠 分析纯500克/瓶理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体无臭, 有清凉咸辣味常温及空气中稳定, 在湿空气中微有溶解性, 在热空气中产生风化现象加热至150℃失去结晶水易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液 pH 值约为8储存： 常温密闭保存危害：无毒4.尿素作用：禽血裂解液成分之一尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。

商品信息：化学试剂 分析纯 500克/瓶（塑料瓶装）理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿储存：密封避光保存危害：避免与皮肤和眼睛接触5.十二烷基硫酸钠(SDS)作用：禽血裂解液成分之一裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸商品信息：500g/分析纯AR理化性质：白色或淡黄色粉末溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚储存：密封阴凉干燥保存 防止受潮受热危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用可引起呼吸系统过敏性反应该品可燃，具刺激性，具致敏性遇明火、高热可燃受高热分解放出有毒的气体6. 1M Tris-HCl(PH8.0)缓冲液 作用：禽血裂解液成分之一提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液 理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g是一种白色结晶或粉末溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质储存：室温保存危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。

螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活商品信息：瓶/250g理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得储存：于阴凉、通风的库房远离火种、热源应与氧化剂分开存放，切忌混储配备相应品种和数量的消防器材储区应备有合适的材料收容泄漏物危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用对眼睛、皮肤有刺激作用本品可燃，具刺激性8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量商品信息：（20mg/mL）1ml/支理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到储存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质 9.Tris饱和酚 （共需60ml，每管2ml）作用：强蛋白质变性剂 商品信息：瓶/250ml理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。

储存：4℃避光保存危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用10.氯仿（三氯甲烷）作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚商品信息：瓶/500ml理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味不溶于水，溶于醇、醚、苯储存：保存在密封的棕色瓶中危害：麻醉性有致癌可能性在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气11.异戊醇作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定商品信息：瓶/500ml理化性质：无色液体，有不愉快的气味微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂储存：储存于阴凉、通风的库房远离火种、热源库温不宜超过30℃保持容器密封应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储采用防爆型照明、通风设施禁止使用易产生火花的机械设备和工具储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。

易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸12.无水葡萄糖作用：ACD抗凝血剂成分之一商品信息：500g/瓶理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜 水中易溶，在乙醇中微溶储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存危害：无五、实验试剂1. 75%的乙醇 {75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇2.ACD抗凝剂 100ml（共需48ml，每管0.8ml）{柠檬酸0.48g + 柠檬酸钠1.32g + 葡萄糖1.47g} → 加水至100ml，灭菌后备用3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0) 10ml + 0.5M EDTA(PH8.0) 20ml} → 加水定容至100ml，备用Ø 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml{水80ml + EDTA-2Na 18.61g} → 用NaOH（约2g）调至PH8.0 → 定容至100ml →分装后高压灭菌备用注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml{氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1） 共需60ml，每管2ml{氯仿-异戊醇（24:1）40ml + Tris饱和酚40ml} = 80ml，4℃保存6. .TE缓冲液 PH8.0 50ml{10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} →→ 定容到50ml → 高压灭菌后冷却4℃保存Ø 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml{水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} → 用NaOH（约2g）调至PH8.0 → 定容至100ml →分装后高压灭菌备用。

注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解Ø 【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml{1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液六、实验步骤1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血＝4：1）Ø 目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月2.取血样(酒精:血＝4:1)680mL至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清；Ø 目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性3.加800mLACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800mLACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；Ø 目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性4.加1700mL裂解液，10mL蛋白酶K（100mg），摇匀，55℃水浴保温过夜；Ø 目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是。