Trizol试剂09204.doc

Trizol Reagent/总 RNA 提取试剂发布日期： [2007-7-13] 共阅[7177]次Trizol Reagent/总 RNA 提取试剂说明书 产品简介TRIzol 是从细胞和组织中提取总 RNA 的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol 能保持RNA 完整性加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中取出水相，用异丙醇可沉淀回收 RNATRIzol 试剂可用于小量样品（ 50－100mg 组织、5×10 6 细胞），也可用于大量样品（≥1g 组织或≥10 7 个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品一个小时内即可完成反应，提取的总 RNA 没有 DNA 和蛋白质污染，可用于 Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase 保护分析等本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持 RNA 的稳定性保存条件2-8℃ 避光保存 12 个月实验前需要准备的试剂氯仿、异丙醇、75% 乙醇（用 RNase-free 水配制）、RNase-free 的水操作步骤1. 匀浆处理（Homogenization）组织中提取总 RNA1) 植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每 50-100mg 植物叶片加入 1ml TRIzol。

2) 动物组织：按 10-30mg 组织加入 1ml TRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆培养细胞中提取总 RNA1) 贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用 TRIzol 进行裂解，每 10 平方厘米培养面积加 1ml TRIzol 2) 悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每 1ml TRIzol 可裂解 5×106 动物或酵母细胞，或 107细菌细胞血液中提取总 RNA直接取新鲜的血液，加入 3 倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置 10 分钟，10,000 rpm 离心1 分钟彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀每 100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入 1ml TRIzol2．分层（ Phase Separation）a. 样品加入 TRIzol 后，室温放置 5min，使样品充分裂解注： 如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存可选步骤： 4℃ 12,000 rpm 离心 10 分钟，取上清如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去取澄清的匀浆溶液进行下一步操作 b. 每 1ml TRIzol 加入 200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置 3-5 min 使其自然分相。

3． RNA 沉淀（ RNA Precipitation）a. 4℃ 12,000rpm 离心 10-15min样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（通常可吸取 550μl）转移到新管中 注：小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致 RNA 样品中有 DNA 污染b. 在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置 10-20min4℃ 12,000 rpm 离心 10min，弃上清，RNA 沉淀于管底4．RNA 漂洗（ RNA Wash）a. RNA 沉淀中加入 1ml 75%乙醇（用 RNase-free 水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀每1ml TRIzol 加入 1ml 75％乙醇b. 4℃ 5,000-8,000 rpm 离心 1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀室温放置 1-2 分钟晾干沉淀注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解5. 溶解 RNA（Redissolving the RNA）沉淀中加入 50-100μl RNase-free 水，轻弹管壁，以充分溶解 RNA，-70℃保存注意事项 1. 经常更换手套。

因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染2. RNA 在 TRIzol 试剂中不会被 RNase 污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了 RNase 的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和枪头都是 RNase-free 的3. RNase-free 水的配制方法：将水加入干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌；RNase-free 的塑料和玻璃器皿处理方法：玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 小时；塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用 DEPC 水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase不同组织或细胞中提取 RNA 预期得率植物叶片 100－200 μg/g 叶片 动物组织 200－400 μg/g 肝脏组织动植物培养细胞 5－10 μg/106 细胞革兰氏阴性细菌 2－10 μg/ml DH5α过夜菌血液 3－5 μg/ml 人全血RNA 纯度及浓度检测完整性 RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：1.2%胶；0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15 分钟）检测完整性由于细胞中 70-80%的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。

动物 rRNA 大小分别约为 5kb 和 2kb，分别相当于 28S 和 18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体 RNA，可见 4 条或更多 rRNA；细菌 rRNA 大小分别约为 4kb 和 2kb，分别相当于细菌 23S 和 16S rRNARNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍，否则表示 RNA 样品的降解出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解纯度 OD260/OD280 比值是衡量 RNA 样品中蛋白质污染程度的指标高质量的 RNA 样品，OD260/OD280 值（ 10mM Tris, pH7.5）在 2.0 左右OD 260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响同一个 RNA 样品，假定在 10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数在 1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯浓度 取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free 水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260 测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算： 终浓度（ng/μl ）=OD260×n (稀释倍数)×40 。