碧云天 emsa试剂盒[1].pdf

化学发光法化学发光法 EMSA 试剂盒试剂盒 产品编号 产品名称 包装 GS009 化学发光法EMSA试剂盒 100次 产品简介：产品简介： ? 化学发光法EMSA试剂盒(Chemiluminescent EMSA Kit)是一种通过Streptavidin-HRP及后续的BeyoECL Plus试剂来实现化学 发光检测Biotin标记的EMSA探针的检测试剂盒同时本试剂盒也提供了EMSA检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液，及 一些关键的相关试剂，可以实现非同位素的EMSA检测 ? 本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和 Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高 ? 本试剂盒采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高 ? 本试剂盒和碧云天的各种生物素标记EMSA探针可以配套使用 ? 本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，其它特定的生物素标记EMSA探针的制备可以使用碧云天的EMSA探针生 物素标记试剂盒(GS008)。

? EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和 标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合 ? 本试剂盒可以用于100个蛋白和探针的结合反应，并足够检测至少10块有生物素标记EMSA探针的膜 包装清单：包装清单： 产品编号 产品名称 包装 GS009-1 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 200µl GS009-2 EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X) 200µl GS009-3 EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10X) 200µl GS009-4 BeyoECL Plus Reagent A 55ml GS009-5 BeyoECL Plus Reagent B 55ml GS009-6 Streptavidin-HRP Conjugate 100µl GS009-7 封闭液 380ml GS009-8 洗涤液(5X) 250ml GS009-9 检测平衡液 250ml — 说明书 1份 保存条件：保存条件： GS009-1至GS009-3和GS009-6在-20℃保存，其余可4℃保存。

如果长期不用，整个试剂盒可-20℃保存，-20℃可以保存更 长时间 注意事项：注意事项： ? 需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂带正电荷尼龙膜(FFN12/FFN16)可以向碧云天订购 ? 如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购GS009B封闭液或GS009W洗涤液(5X) ? 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作 使用说明：使用说明： 1. 探针的标记：探针的标记： 可以直接选购碧云天的生物素标记EMSA探针，或使用碧云天的EMSA探针生物素标记试剂盒(GS008)或其它合适的试剂 盒进行EMSA探针的生物素标记 2. 探针的纯化和检测：探针的纯化和检测： 碧云天的各种生物素标记EMSA探针都已经过纯化，可以直接使用；对于使用碧云天的EMSA探针生物素标记试剂盒 (GS008)等试剂盒标记的EMSA探针，通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针有些时候，纯化后的探针会改 善EMSA的电泳结果详细的探针纯化和探针的标记效率的检测请参考EMSA探针生物素标记试剂盒的相关说明 3. EMSA胶的配制：胶的配制： A. 准备好倒胶的模具。

可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA胶的模具制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留 B. 按照如下配方配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大) TBE buffer (10X) 1.0ml 重蒸水 16.2ml 39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2ml 80% 甘油 625µl 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) 150µl TEMED 10µl C. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。

避 免产生气泡，并加上梳齿如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理 4. EMSA结合反应：结合反应： A. 如下设置EMSA结合反应： 阴性对照反应：阴性对照反应： Nuclease-Free Water 7µl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 0µl 标记好的探针 1µl 总体积 10µl 探针冷竞争反应：探针冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4µl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl 未标记的探针 1µl 标记好的探针 1µl 总体积 10µl Super-shift反应：反应： Nuclease-Free Water 4µl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl 目的蛋白特异抗体 1µl 标记好的探针 1µl 总体积 10µl 样品反应：样品反应： Nuclease-Free Water 5µl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl 标记好的探针 1µl 总体积 10µl 突变探针的冷竞争反应：突变探针的冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4µl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl 未标记的突变探针 1µl 标记好的探针 1µl 总体积 10µl B. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发 生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。

然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分 钟 C. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结 合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以 在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可 5. 电泳：电泳： A. 用0.5XTBE作为电泳液按照10V/厘米的电压预电泳10分钟预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释 好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行 B. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲 液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况 C. 按照10V/厘米的电压电泳确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压电泳至EMSA/Gel-Shift上 样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳 6. 转膜：转膜： A. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。

尼龙膜自始至终仅能使用镊 子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处 B. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿 C. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡 D. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡 E. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡 F. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白 以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟如果胶较厚，则需适当延长转膜时间转膜时需保持转膜 液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温具体的电转膜 方法请参考电转膜装置的使用说明 G. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体立即进入下一 步的交联步骤，不可使膜干掉。

7. 交联：交联： A. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒如果没有紫外交联仪可以使用普 通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟也可以使用超净工 作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索 B. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联 一次，以进一步。