《种质离体保存》PPT课件.ppt

第七章　第七章　种质离体保存种质离体保存概 述低温 保存的 细胞学 基础保存中 遗传变异 的检测与利用影响 保存 效果的 因素超低温保存的 方法1几个相关概念（见几个相关概念（见《《园艺植物育种学园艺植物育种学》》））Ø种种质（质（germplasmgermplasm）：）：决定生物的遗传性状，并将遗传信息从决定生物的遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质亲代传递给子代的遗传物质种质资源包括动植物的种质资源包括动植物的个体、个体、器官、组织、细胞器官、组织、细胞甚至控制生物遗传性状的甚至控制生物遗传性状的基因Ø种质库：又称基因库（种质库：又称基因库（GenBankGenBank），是以种为单位的群体中的），是以种为单位的群体中的全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成Ø种质资源（种质资源（germplasmgermplasm resource resource））或遗传资源（或遗传资源（genetic genetic resourceresource）：具有种质并能繁殖的生物体具有种质并能繁殖的生物体Ø种质资源保存：为避免种质资源的流失，种质资源保存：为避免种质资源的流失，利用自然或人工创利用自然或人工创造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持。

造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持2种质资源保存方法种质资源保存方法就地保存（自然保护区）就地保存（自然保护区）迁地保存（种质圃保存）迁地保存（种质圃保存）种子保存种子保存离体培养保存离体培养保存基因文库保存基因文库保存常温限制生长保存常温限制生长保存中低温调控生长保存中低温调控生长保存低温干燥保存低温干燥保存减压保存减压保存低温保存低温保存（低于（低于-80 ℃-80 ℃））超低温保存超低温保存（（-196 ℃-196 ℃））难以长期保持种质寿难以长期保持种质寿命，对种质保存的作命，对种质保存的作用不是很大用不是很大按保存条件按保存条件（温度、含氧量等）（温度、含氧量等）按材料和方式按材料和方式3第一节第一节 概概 述述一、植物种质资源低温保存的意义一、植物种质资源低温保存的意义Ø防止物种或品种灭绝防止物种或品种灭绝Ø节省人力物力节省人力物力Ø便于种质资源的国内外交流便于种质资源的国内外交流4二、超低温保存的概念二、超低温保存的概念 低温保存（低温保存（cryopreservation））是由是由cryo和和preservation组成，在组成，在英语中英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。

从词义为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的看，低温所涉及的温度范围是不确定的 超低温超低温:≤≤-80℃ 极低温极低温:≤≤-70℃ (干冰温度干冰温度) 低温低温:≤≤4℃ 5 但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度如但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡如甜橙树发生冻害的临界温度通常在受冻害而死亡如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5℃，枳壳，枳壳通常在通常在-20℃左右（沈德绪等，左右（沈德绪等，1986）6Ø低温保存低温保存（（CryopreservationCryopreservation），是指将植物的组织或），是指将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在低于细胞经过防冻处理后，在低于-80℃-80℃条件下保存的方法条件下保存的方法 Ø超低温保存超低温保存：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在-196℃-196℃的极端低温下保存的方法。

的极端低温下保存的方法7超低温保存的优点超低温保存的优点: :Ø在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，完全停止，呈现呈现““假死假死””状态因此，细胞、组织和器状态因此，细胞、组织和器官在此过程中官在此过程中不会不会发生遗传性状的改变，也发生遗传性状的改变，也不会不会丢失形丢失形态发生的潜能态发生的潜能Ø在在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，故能够实现故能够实现长时期的保存长时期的保存8超低温保存的意义超低温保存的意义:Ø可以在可以在有限空间内保存大量种质材料有限空间内保存大量种质材料；；Ø与种子保存相比，与种子保存相比，可以不受时间和种子含水量的制约可以不受时间和种子含水量的制约；；Ø与试管苗相比，可以与试管苗相比，可以避免频繁继代培养造成的变异避免频繁继代培养造成的变异，并，并大幅度减少工作量大幅度减少工作量9 常用的超低温保存方法：常用的超低温保存方法：Ø冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法Ø玻璃化处理的超低温保存法玻璃化处理的超低温保存法10三、超低温保存的研究概况三、超低温保存的研究概况1．超低温保存技术的发展．超低温保存技术的发展2．用于超低温保存的植物材料．用于超低温保存的植物材料3．超低温保存的植物种类．超低温保存的植物种类 Ø据王君晖等据王君晖等19981998年统计，有年统计，有4040多个属多个属6060多个种的木本植物已进多个种的木本植物已进行了超低温保存研究，其中：行了超低温保存研究，其中： Ø种子、胚、胚轴和胚的保存一般采用干冻法；种子、胚、胚轴和胚的保存一般采用干冻法； Ø茎尖和分生组织多采用玻璃化法或包埋脱水法；茎尖和分生组织多采用玻璃化法或包埋脱水法； Ø愈伤组织和悬浮细胞大多采用两步法。

愈伤组织和悬浮细胞大多采用两步法1112第二节第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础植物材料超低温冻存的细胞学基础一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60-90％细胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易％，很容易冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水那样在那样在0℃就结冰131.1.1.1.细胞内外水分的冻结特性细胞内外水分的冻结特性　　　　理论上讲，细胞外水的冻结温度为理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5-5～～-15-15℃，细胞内，细胞内游离水的冻结温度为游离水的冻结温度为-25-25℃，故，故在在-30-30℃时，细胞内的游离水时，细胞内的游离水全部被冻结，而结合水则在全部被冻结，而结合水则在-100-100℃温度下也不发生冻结温度下也不发生冻结14Ø根据根据LuyetLuyet的冻结理论（的冻结理论（19371937），细胞内游离水的冻结），细胞内游离水的冻结温度（温度（-30℃-30℃）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法一般以胞冻存的两步冻结法一般以-30℃-30℃为基础的。

为基础的Ø也就是说，也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技术的关键术的关键15超低温保存的原理超低温保存的原理　　为什么在　　为什么在超低温条件下材料不会冻死超低温条件下材料不会冻死关键原因是进关键原因是进行了行了“防冻处理防冻处理”，，具体如下：具体如下：Ø使用冷冻防护剂可以使用冷冻防护剂可以降低培养基和培养材料的冰点降低培养基和培养材料的冰点Ø使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发生轻微质壁分离，从而生轻微质壁分离，从而提高了组织和细胞的抗寒能力提高了组织和细胞的抗寒能力16根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：Ø分步冷冻分步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，：在细胞内游离水冻结之前，先使细胞外水分冻结，先使细胞外水分冻结，从从而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致细胞适度脱水细胞适度脱水，利于细胞的冷，利于细胞的冷冻保存Ø快速冷冻：快速冷冻：也称也称玻璃化冷冻保存玻璃化冷冻保存技术，通过迅速降温，使技术，通过迅速降温，使细胞内细胞内水冻结产生的冰晶体积非常小水冻结产生的冰晶体积非常小，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。

免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的172.2.低温下细胞的致死损伤低温下细胞的致死损伤　超低温保存的一般过程：　超低温保存的一般过程： 超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰为为此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小预冻预冻超低温长期保存超低温长期保存解冻解冻18第三节第三节 超低温保存的方法超低温保存的方法 超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评价等步骤价等步骤降温冰冻方法降温冰冻方法玻璃化保存方法玻璃化保存方法超低温保存的方法超低温保存的方法19一、传统的降温冰冻方法一、传统的降温冰冻方法1．．慢冻法：以慢冻法：以0.5- -2℃/min速度降温至速度降温至-100℃后投入液氮，或以该速度后投入液氮，或以该速度一直降温至一直降温至-196℃后投入液氮。

后投入液氮 在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰晶，又能防止因溶质含量增加引起的晶，又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应溶液效应”因此，对于原生因此，对于原生质质体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好202．．快冻法：快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对含水量高的细胞培养物则不适合含水量高的细胞培养物则不适合213．分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的．分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的速度速度(0.5 ～～ 4℃/min)降至降至-30～～-40 ℃，停留，停留0.5～～1h，，然后直接投入液氮中保存停留的目的是诱导细胞外水然后直接投入液氮中保存停留的目的是诱导细胞外水分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一性冰晶。

一性冰晶224. 干冻法：将样品在高浓度干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基渗透性化合物培养基上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数小时小时(使含水量降至使含水量降至17～～40％％)或用藻酸盐包埋后投入液氮或用藻酸盐包埋后投入液氮保存该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、保存该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料23二、玻璃化保存方法二、玻璃化保存方法Ø玻璃化（玻璃化（vitrificationvitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化过程Ø使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度溶液浓度241.1.玻璃化法玻璃化法 玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液玻璃化溶液快速脱水快速脱水后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃态。

在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不发态在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不发生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤当保生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤当保存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生如果材料能存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生如果材料能够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功252.2.包埋玻璃化法包埋玻璃化法Ø包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合 先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高，璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高，可能是因为藻酸钙的包埋减轻了可能是因为藻酸钙的包埋减轻了玻璃化溶液玻璃化溶液的毒性26包埋玻璃化的实例包埋玻璃化的实例(a) (a) 将离体培养诱导的茎尖在黑暗和低温（将离体培养诱导的茎尖在黑暗和低温（4℃4℃）条件下进行锻炼条件下进行锻炼b) (b) 用海藻酸钙包埋茎尖用海藻酸钙包埋茎尖。

c) (c) 将包埋体置于超净工作台上吹风干燥将包埋体置于超净工作台上吹风干燥d) (d) 将包埋体在含将包埋体在含0.75 M0.75 M蔗糖的培养基上预培养，进一步脱水蔗糖的培养基上预培养，进一步脱水e) (e) 将包埋体置于冷藏管中，投入液氮中保存将包埋体置于冷藏管中，投入液氮中保存f) (f) 快速化冻快速化冻g) (g) 植株再生植株再生27第四节 影响超低温保存效果的因素材料的基本特性材料的基本特性冰冻保护剂的应用冰冻保护剂的应用再生技术再生技术预培养与低温锻炼预培养与低温锻炼解冻方法解冻方法28一、材料的基本特性Ø材料的基本特性材料的基本特性包括植物的包括植物的基因型基因型、、抗冻性、抗冻性、器官、组器官、组织或细胞的织或细胞的年龄以及生理状态等年龄以及生理状态等（（特别是基因型）特别是基因型） Ø植物细胞培养物的植物细胞培养物的生长年龄，生长年龄，也是决定冻后细胞成活率也是决定冻后细胞成活率的最重要因素之一的最重要因素之一指数生长期和滞后期指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻的幼龄细胞抗冻力强，存活率高力强，存活率高29二、预处理和低温锻炼Ø预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以减少细胞内减少细胞内自由水含量，减轻冷冻伤害自由水含量，减轻冷冻伤害，提高抗冻能力。

提高抗冻能力 Ø预处理措施预处理措施: :包括提高培养基的糖浓度、包括提高培养基的糖浓度、提高渗透压以减少细胞内提高渗透压以减少细胞内自由水含量自由水含量；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如如0.3-1.00.3-1.0Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂渗透压调节剂，，5-105-10％％DMSODMSO等等冰冻保护剂冰冻保护剂 Ø低温预培养：将材料于低温预培养：将材料于0℃0℃以上以上低温、黑暗或弱光低温、黑暗或弱光下离体培养几周，下离体培养几周，可明显增强其忍耐冷冻能力可明显增强其忍耐冷冻能力 30三、冰冻保护剂的应用　　冰冻保护剂（　　冰冻保护剂（CryoprotectiveCryoprotective agent agent，，CPACPA））也称抗冻剂，为也称抗冻剂，为植物低温保存必不可少植物低温保存必不可少Ø特点：特点：易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除 Ø作作用用：：增增加加膜膜透透性性，，加加速速细细胞胞内内水水流流到到细细胞胞外外结结冰冰；；稳稳定定细细胞胞膜膜结结构构，，阻阻止止低低温温伤伤害害；；降降低低冰冰点点，，提提高高溶溶液液的的粘粘滞滞性性，，阻阻止止冰冰晶晶的的生长生长。

Ø依据渗透性的有无，可将依据渗透性的有无，可将CPACPA分为两类：分为两类： 渗透型渗透型非渗透型非渗透型&31渗透型冰冻保护剂渗透型冰冻保护剂特点：特点：多为中性低分子物质，在溶液中易与水分子结合发生水合作多为中性低分子物质，在溶液中易与水分子结合发生水合作用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰点，从而弱化了水结晶的过用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰点，从而弱化了水结晶的过程，达到保护材料的目的程，达到保护材料的目的 Ø种类：常用的有甘油、二甲基亚砜（种类：常用的有甘油、二甲基亚砜（DMSODMSO）、乙二醇（）、乙二醇（EGEG）、）、乙乙酰胺、丙二醇（酰胺、丙二醇（PGPG） Ø不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力及其对水分子活性的影响不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力及其对水分子活性的影响也有不同，如甘油适用于慢速冷却，也有不同，如甘油适用于慢速冷却，DMSODMSO容易渗入细胞，但有轻微容易渗入细胞，但有轻微毒性 32非渗透型冰冻保护剂非渗透型冰冻保护剂Ø特点：特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。

作用Ø种类：种类：主要有聚乙烯吡咯烷酮主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)、葡聚糖、葡聚糖( (DextraneDextrane) )、、聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、白蛋白、白蛋白(Albumin)(Albumin)、羟乙基淀粉、羟乙基淀粉(HES)(HES)等33四、解冻方法四、解冻方法　　根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式：　　根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式： Ø快速解冻：快速解冻：能使材料迅速通过冰融点的危险温度区能使材料迅速通过冰融点的危险温度区(-50(-50～～- -10 ℃)10 ℃)，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤通常的做通常的做法是把样品放入法是把样品放入3737～～45℃45℃温水浴中，待冰完全溶化后（约温水浴中，待冰完全溶化后（约90s90s））立即移开立即移开Ø慢速解冻：慢速解冻：对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先置于置于0℃0℃下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好34　另外，不同　另外，不同材料或方法材料或方法采用的化冻方式也有不同：采用的化冻方式也有不同：Ø材料含水量：材料含水量：液泡小、含水量少的细胞液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法；可采用快速化冻的方法；液泡大、含水量高的细胞液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用则一般需要采用慢速化冻法。

慢速化冻法Ø材料的材料的生理状态生理状态：：生长季节中的材料生长季节中的材料，一般在，一般在3737～～45℃45℃温水浴温水浴中中快速化冻（快速化冻（500-700℃/min500-700℃/min））比在室温下慢速化冻要好，而比在室温下慢速化冻要好，而木本木本植物的冬芽植物的冬芽，在超低温保存后，必须在，在超低温保存后，必须在0℃0℃低温下进行慢速化冻才低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果能达到良好的效果Ø保存方法：保存方法：玻璃化冻存的材料玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，在保存终止后，要求快速化冻，以防止次生结冰对组织细胞造成伤害以防止次生结冰对组织细胞造成伤害351. 冷冻保存后细胞和器官活力的检测冷冻保存后细胞和器官活力的检测再培养法再培养法测定存活率测定存活率存活细胞存活细胞(或器官或器官)数目数目    解冻解冻(或器官或器官)数目数目存活率存活率=×100%五、培养及再生36　　经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心　　经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心维护：维护： Ø培养培养: :一般将材料培养在黑暗或弱光下培养一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-21-2周周，再转入正常光，再转入正常光照下培养。

照下培养 Ø培养基培养基: :一般是保存前使用的培养基一般是保存前使用的培养基，但有时需将大量元素或琼，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，或在培养基中附加一定量的脂含量减半，或在培养基中附加一定量的PVPPVP、、水解酪蛋白等，以水解酪蛋白等，以利于材料的恢复生长利于材料的恢复生长 2. 培养及再生培养及再生37六、超低温保存中变异及其检测　　保持原有种质的遗传稳定性，是种质保存的基本要求　　保持原有种质的遗传稳定性，是种质保存的基本要求 Ø超低温保存的遗传变异属于超低温保存的遗传变异属于体细胞变异体细胞变异 Ø变异与起始细胞的生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等变异与起始细胞的生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等有关（有关（变异基本上都是在非超低温下产生的变异基本上都是在非超低温下产生的） Ø在保证保存材料活性的同时，在保证保存材料活性的同时，应尽量采用减少变异的方法技术应尽量采用减少变异的方法技术 38 为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系目在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。

目前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如RFLP和和RAPD）等检测方法常常单独或结合起来用于）等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析遗传变异分析39种质超低温保存法程序示意图种质超低温保存法程序示意图植物器官、组织和细胞植物器官、组织和细胞细胞生长或植株再生细胞生长或植株再生再培养再培养玻璃化冻存法玻璃化冻存法 分步冷冻法分步冷冻法（两步法、（两步法、多步冰冻法）多步冰冻法）加冷冻防护剂（加冷冻防护剂（0℃℃ ））快速冷冻法快速冷冻法（降温速度（降温速度1000 ℃/min 1000 ℃/min ）） 预处理预处理（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼）（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼）种质库（种质库（-196 ℃-196 ℃ ））迅速解冻（迅速解冻（34-45 ℃ ℃ ））包埋干燥冷冻法包埋干燥冷冻法40 植物种植物种类参考文献参考文献白花三叶草（Trifolium repens）Yamada et al. 1991白薯（Ipomoea batatas）  Towill 1992百合（Lilium japonicum Thumb）Matsumoto 1995, Sakai & Matsumoto 1996菠萝（Ananas comosus）Gonzalez-Arnao et al. 1998薄荷 (Mentha spicata L.)Hirai et al. 1999茶（Camellia sinensis）Kuranuki & Sakai 1994大麻（Humulus lupulus L.）Martínez 1999大蒜（Allium sativum L.）Niwata et al. 1998豆荚树 (Acacia mangium)Sudarmonowati et al. 1998番木瓜（Carica papaya）Towill 1990甘蔗 (Beta vulgaris L. clone SES1) Vandenbussche et al. 1998, 柑橘（Poncirus trifoliate (L.)Raf.）Gonzalez-Arnao et al.1998 龙胆（Gentiana scabra Bunge var bucrgcri Maxim.）Sukai and Matsumoto 1996 芦笋（Asparagus officinalis）Uragami et al. 1990, Kohmura et al. 1992 陆生兰（Cymbidium spp）Thinh et al. 1998 马铃薯（Solanum tuberosum）Fabre & Dereuddre 1990 猕猴桃（Actinidia deliciosa）Suzuki et al.1994 苜蓿 (Medicago sativa L.) Shibli et al 2001 苹果（Matus domestica）Niino et al. 1992, Niino & Sakai 1992, Paul et al 2000 葡萄（Vitis vinifcra L. cv. chardonnay）Plessoa et al. 1994 桑树（Manihot esculenta）Niino et al. 1992 山茱菜（Wasabia japonica）Matsumono et al. 1994, Sakai & Mataumoto 1996 麝香石竹（Dianthus caryophullus）Langis etal. 1990, Towill 1990 柿 (Diospyros kaki Thunb.) Matsumoto et al. 2001 薯蓣 (Dioscorea spp) Mandal 1995 香蕉 (Musa spp.) Helliot et al. 2002 杏（Prunus dulcis Mill.）Shatnawi et al. 1998 洋梨（Pyrus communis）Niino et al. 1992, Dereuddre etal. 1990, Niino & Sakai 1992 芋（Colocasia esculenta(L.) schott）Takagi et al.1997 芸苔（Beta vulgaris）Kohmura et al.1992  玻玻璃璃化化法法和和包包埋埋脱脱水水法法保保存存植植物物茎茎尖尖文文献献一一览表表 41冷冻保存的应用前景冷冻保存的应用前景1、长期保存种质的遗传稳定性。

长期保存种质的遗传稳定性2、长期保存去病毒的种质长期保存去病毒的种质3、保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源4、保持不稳定性的培养物，如单倍体保持不稳定性的培养物，如单倍体5、保持培养细胞形态发生的能力保持培养细胞形态发生的能力6、防止种质衰老防止种质衰老7、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难8、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种9、便于国际间的种质交换便于国际间的种质交换42液氮罐（30L）43制冰机44离心管45过滤离心管46附件：常用的超低温冻存方法47一. 快速冷冻法　　把材料从　　把材料从0℃0℃，或经其它，或经其它预处理后，直接投预处理后，直接投入液氮中，入液氮中，其降温速度达其降温速度达1000℃1000℃以上以上/min/min 适用于直接快速冷冻法的植物材料为：适用于直接快速冷冻法的植物材料为：Ø高度脱水高度脱水的材料，如种子、花粉、球茎块根；的材料，如种子、花粉、球茎块根；Ø抗寒性较强的木本植物的枝条或芽抗寒性较强的木本植物的枝条或芽，如经过冬，如经过冬季低温锻炼的材料。

季低温锻炼的材料 48二. 分步冷冻法两步冰冻法两步冰冻法多步冰冻法多步冰冻法49两步（级）冰冻法两步（级）冰冻法Ø第一步：降温至转移温度第一步：降温至转移温度样品在添加冰冻保护剂后，样品在添加冰冻保护剂后，用可控速率的降温设备（程序降温仪），以某种速率用可控速率的降温设备（程序降温仪），以某种速率（一般在每分钟降（一般在每分钟降0.10.1～～0.5℃0.5℃之间），将样品降温至之间），将样品降温至转转移温度移温度（一般为－（一般为－4040～－～－70℃70℃）Ø第二步：第二步：将处于转移温度的样品投入将处于转移温度的样品投入液氮中液氮中保存：保存：样品在添加冰冻保护剂后样品在添加冰冻保护剂后转移温度转移温度液氮液氮0.10.1～～0.5℃/min0.5℃/min50多步冰冻法多步冰冻法　　将经保护剂处理的材料在　　将经保护剂处理的材料在0℃0℃预处理后预处理后，依，依次通过次通过不同温度的冰浴不同温度的冰浴，如－，如－10℃10℃，－，－15℃15℃，，－－23℃23℃，－，－40℃40℃等一般每级约等一般每级约停留停留5 5分钟分钟，最，最后投入液氮中后投入液氮中 　　简成令等（　　简成令等（19871987）报道，将甘蔗愈伤组织）报道，将甘蔗愈伤组织在在0℃0℃的冰冻保护剂（的冰冻保护剂（1010％％DMSODMSO＋＋0.5 mol/L0.5 mol/L山山梨醇）中预处理梨醇）中预处理3030～～45 min45 min，接着用，接着用1℃/min1℃/min的的速度从速度从0℃0℃降到－降到－40℃40℃，停留，停留1 1～～3 h3 h，最后投入，最后投入液氮中保存，半年后仍可再生大量植株。

液氮中保存，半年后仍可再生大量植株 51三. 玻璃化冻存法　　玻璃化（　　玻璃化（VitrificationVitrification））是指液体转变为非是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程晶体（玻璃态）的固化过程 Ø使溶液玻璃化的途径有两条：使溶液玻璃化的途径有两条：一是一是极快地提高降极快地提高降温的速率；温的速率；二是二是增加溶液的粘稠度增加溶液的粘稠度Ø当抗冻剂溶液（如甘油、当抗冻剂溶液（如甘油、DMSODMSO、、丙二醇等）的浓丙二醇等）的浓度为度为4040～～6060％（％（W/VW/V））时，较容易形成玻璃态时，较容易形成玻璃态。