纳豆激酶的提取、提纯程序.doc

纳豆激酶的提取、提纯程序及活性测定孙雪天津工业生物技术研究所 2013E8018261011由于我们实验室较少做酶的分离提纯， 所以我选择了自己比较感兴趣的一种 酶——纳豆激酶选择此酶的理由： 人体内的血栓常引发脉管栓塞、 脑血栓中风、 急性心肌梗 塞等严重的心脑血管疾病， 对中老年人的身体健康造成了很大的危害， 目前全世 界有血栓患者约 1 500 万人，潜在的溶栓剂市场有 20 亿美元 [1] 但当前的溶栓 剂，如尿激酶 ( SK) 和链激酶 (UK) ，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选 择性，副作用大； 第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂， 存在着价格高的 缺点等，难以成为适用于大众的药品 而纳豆激酶具有溶栓能力强、 无任何毒副 作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点 [2] ，市场前景极为诱人 [3]纳豆激酶(Nattokinase , N K;也称 Subtilisin NAT ,Subtilisin BSP)是由纳豆 菌( Bacill us subtilis var. nat to) 产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种 枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin),属于水解酶类，催化蛋白质的水解。

现在可以由分 离纯化的纳豆激酶 DNA 序列推出其氨基酸序列 ,根据该顺序计算出该酶的分子 量为27 728 U[4 ]，远小于尿激酶的分子量54 000 u用Svunsson柱型电泳法等电 聚焦测得纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其 p I 值为 8. 6 0±.3 [5 ] 提取提纯程序：纳豆激酶是胞外酶 [6]，故可利用纳豆菌的发酵液提取， 省去了细胞破碎和缓 冲液抽提的步骤具体方法如下 [7]：(1) 将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中， 37°C恒温培 养，4 000 rpm离心30min,取上清液，即为粗酶液2) 用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等取上清液缓慢加入硫酸铵至25%饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在 上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为 60%，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液3）粗酶液经透析脱盐，除去硫酸铵4）为了最终获得符合要求的产物，将样品进行多级层析，目的是先层析浓缩 样品和去除杂质， 再层析去除残存杂质、 目的蛋白的多聚物或降解片段。

凝胶层 析和离子交换层析可提出较高纯度的酶， 但是应注意层析介质的选择 将发酵液 经硫酸铵沉淀后通过Superdex 75凝胶层析和SPSepharose Fast Flow离子交换层 析[8]，发现经硫酸铵沉淀后得到的粗酶中杂蛋白不多，凝胶过滤可分离一部分杂 蛋白，再经离子交换层析后，电泳可得到单一条带的纳豆蛋白产品， Mr 为27 700 以上每一步都要进行酶的活性测定 测定方法为：纤维蛋白块溶解时间 （ CLT） 法 [9]该法也是参照t2PA、尿激酶等溶栓物质活性测定方法加以改进而建立的具体方法：0 C下,在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、纳豆激酶 样品溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37 C恒温水浴中从纤维蛋白形成起开 始计时, 随着反应液混浊 ,有气泡上升到液面 ,至气泡不再冒出时所用的时间作为 纤维蛋白溶解的时间 同样以标准纳豆激酶或尿激酶、 纤溶酶等作为标准品绘制 标准曲线以CLT对纳豆激酶浓度的对数作图,在10〜70卩g范围内有很好的 线性关系步骤总蛋白/mg总酶活力/U比活U/mg回收率/%纯化倍数上清498610683221.41硫酸铵沉淀65.878346126.71005.9Superd ex 75凝胶 层析14.657142487.685.622.8SPSepharoseFast Flow离子交换层析8.575216608.662.528.4酶的提取提纯记录表[10]经过上述步骤的分离纯化，该纳豆激酶已经达到电泳纯参考文献[1] Datar R V ,CartwrightT,Rosen C G. [J ] .Biotechnology ,1993 ,11 (3) :349.[2] FujtaM,Hong K, Iro Y . [J ] . Biological and Pharmaceutical Bulletin ,1995 ,18(9) :1194 - 1196.3]阳承利，邢建民，刘俊果等 . [J ]现代化工 ,2004,24(2)： 23-25.[4] Nakamura , T. , Y. Yamagata , & E. Ichishima. Nucleotide se2quence of the subtilisin NAT gene ,aprN ,of Bacill us subtilis( natto) [ J ] . Biosci. Biotechol. Biochem. , 1992 , 56 : 1 869 -1 871.[5] Sumi , H. , H. Hamada , & H. Tsushima , et al . A novel fibri2nolytic enzyme( nattokinase) in the vegetable cheesenatto : atypical and popular soybean food in the Japanese diet [J ] . Expe2rientia ,1987 ,43 :1 110 - 1 111.[6] 谢秋玲 ,郭勇,林剑,等. 纳豆激酶的合成机制 [J ] . 暨南大学学报 (自然科学 版 ),2001 ,22 :110 - 114.[7] 江晓．产酶纳豆菌株的筛选及纳豆激酶特性研究 [D] ．南京：南京农业大 学硕士学位论文。

1999：6.[8] 高大海，梅乐和，林东强，等•纳豆激酶的分离纯化及酶学性质的研究// 第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集南京． 2004．南京： 中国化工协会， 2004． 439-443．[9] 须见洋行 ,中岛伸佳 , 田谷直俊 . The method of determination of the thrombolytic enzyme nattokinase[ J ] . J . Brew. Soc.Japan ,1993 ,88 :482 - 486.10］肖霞，员世宇，段智变 .纳豆激酶分离纯化及其兔抗血清的制备山西 农业大学学报（自然科学版） 2009,29（4）： 308-311.。