凝胶迁移实验.docx

酣京澳唆物■Dangao「氐耐匸讹心凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay ）是一种研究DNA结 合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析这一技术最初 用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用实验步骤：探针的标记—探针的纯化—EMSA胶的配制—EMSA结合反应—电泳分析一、 探针的标记1. 设置探针标记的反应体系；2. 使用水浴或PCR仪，37°C反应10分钟；3. 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应4. 再加入89微升TE,混匀此时可以取少量探针用于检测标记的效率通常标记的效率在 30%以上，即总放射性的 30%以上标 记到了探针上为实验简便起见，通常不必测定探针 的标记效率5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天标记好的探针可以保存在 -20C二、 探针的纯化1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200 微升的无水乙醇，混匀2. 在-70C至-80C沉淀1小时，或在-20C沉淀过夜。

3. 在4C，12 000 g-16 000 g离心30分钟小心去除上清，切不可触及沉4. 在4C, 12 000 g-16 000 g离心1分钟小心吸去残余液体微晾干沉淀，但不宜过分干燥5•加入100微升TE，完全溶解沉淀标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超 过3天标记好的探针可以保存在 -20C三、 EMSA胶的配制1. 准备好倒胶的模具可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具最好选 择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作为得到更好的结果，可以选择可灌制较 大 EMSA 胶的模具2. 按照如下配方配制 20 毫升 4％的聚丙烯酰胺凝胶（注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis 对结果影响不大）3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加 入到制胶的模具中避免产生气泡， 并加上梳齿如果发现非常容易形成气泡，可以把一 块制胶的玻璃板进行硅烷化处理四、 EMSA结合反应1.如下设置EMSA结合反应阴性对照反应：(1) Nuclease-Free Water ：7 微升2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ： 2 微升。

3 )细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0 微升 4)标记好的探针 ： 1 微升 5)总体积 ： 10 微升样品反应：( 1) Nuclease-Free Water ： 5 微升2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升 3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ： 2 微升 4)标记好的探针： 1 微升 5)总体积： 10 微升探针冷竞争反应：( 1) Nuclease-Free Water ： 4 微升2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升 3)细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2 微升 4)未标记的探针： 1 微升5)标记好的探针： 1 微升 6)总体积 ： 10 微升突变探针的冷竞争反应：( 1) Nuclease-Free Water ： 4 微升2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升 3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ： 2 微升 4)未标记的突变探针: 1 微升 (5)标记好的探针: 1 微升 6)体积 : 10 微升Super-shift 反应:( 1) Nuclease-Free Water: 4 微升。

2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ： 2 微升 3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 2 微升 4)目的蛋白特异抗体 : 1 微升 (5)标记好的探针: 1 微升 6)总体积 : 10 微升2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25T)放 置 10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应然 后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25^)放置20分钟3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样注意：有些时候 溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液如果 对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量■Dpngao「乐耐匸五皿飾的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可五、 电泳分析1. 用0.5XTBE作为电泳液按照10V/厘米的电压预电泳10分钟预电泳的时候如果有空余 的上样孔，可以加入少量稀释好的 1X 的 EMSA 上样缓冲液（蓝色），以观察电压是否正常进 行2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。

在多余的某个上样孔内加入 10 微升稀释好 的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色），用于观察电泳进行的情况3•按照10 V/厘米的电压电泳确保胶的温度不超过30r，如果温度升高，需要适当降低电 压电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸小心取下夹有EMSA胶的胶板， 用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液小心打开两块胶板中的上面一块（注：通 常选择先移走硅烷化的那块玻璃板），把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻 轻把滤纸和胶压紧滤纸被胶微微浸湿后（大约不足1分钟），轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶 会被滤纸一起揭起来把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜 膜和胶之间没有气泡5•干胶仪器上干燥EMSA胶然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测EMSA实验成功的关键因素：1. 试验设计用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间梯度的问题,这个很关键！总结建议:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的 时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有 合适的浓度！二是用药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产 生细胞因子的过程。

时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点2. 核蛋白样品的制备（1） 注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和 构像；（2） 掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋 白的浓度往往不会很高，但是 EMSA 试验对核蛋白的浓度要求还是比较高的! 一般要求在 1ug/ul 以上！有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到 结果这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失3） 同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用 细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会不容易 得到EMSA阳性结果！3. 探针的制备:生物素标记到 3'端还是5'端？其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏 度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序 如下：合成寡核苷酸---标记生物素一纯化一退火合成双链•也是一个比较复杂的过程在E MSA操作中会用到同位素，要注意实验室环境和实验员的保护）■Dpngao「氐耐匚五n®4. EMSA 实验技术要点（1） 制胶必须是非变性PAGE凝胶，我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要，直接影 响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（ 40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O （蒸馏水）14.8mlTEMED （四甲基乙二氨）20山脱气 10min10% AP （过硫酸氨）120山总量 20.0ml（2） 探针用量：这相当于10-50fmoles的DNA探针。

我们通常是最少50fmol.（3） 蛋白样品用量：一般用量在2---20ug（控制在1-5山）蛋白,总体系15ul.细胞核抽屉物浓 度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.其他的对照的含义：♦.常规反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针）；♦阴性对照反应（核蛋白+标记探针）；♦ 阳性对照（核蛋白＋标记探针）♦ 探针冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针 100 倍量的未 标记探针）；♦ 突变探针的冷竞争反应（含激活的目的转录因子的 核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍 量的未标记突变探针）；♦ Super-shift 反应（含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗 体）.（4） 预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上120V预电泳1小时；务必换掉预电泳的缓冲液，用 新的0.25X TB低温下150V,电泳约60分钟注意横压电泳的时候注意电流的数字变化记 录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!（5） 电转运在0.5X TBE中390mA电转移40分钟，注意转运膜的选择，有一种离子加强型的转运效果比 较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!（6） 紫外交联： 正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作 台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!（ 7）化学发光反应包括 Blocking Buffer 30 分钟封闭, Streptavidin-HRP 标记, Washing Buffer 洗涤； Equilibration Solution 平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的 表面一定不能干燥!二是 Streptavidin-HRP 不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在将膜放在 液体中孵浴.（ 8）化学发光图像显示 两种方法：化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像 操作基本和 Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性的,不能重复使用, 一定保存好图 片!由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块一块的而不像 WB 那样很规整的一条细线,这个很正常!。