8 细胞骨架的观察.ppt

实验七实验七 细胞骨架微丝的细胞骨架微丝的 光学显微观察光学显微观察•实验目的实验目的•概述概述•实验原理实验原理•仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂•实验步骤实验步骤•实验报告及思考题实验报告及思考题•下一次实验下一次实验下一次实验下一次实验预告预告预告预告1 1 实实 验验 目目 的的掌握用考马斯亮蓝掌握用考马斯亮蓝R250染色观染色观察植物细胞内察植物细胞内微丝微丝的方法 细胞骨架的观察细胞骨架的观察2 2　　　　微丝概述•细胞骨架（细胞骨架（细胞骨架（细胞骨架（cytoskeletoncytoskeletoncytoskeletoncytoskeleton）是指真核细胞中的）是指真核细胞中的）是指真核细胞中的）是指真核细胞中的蛋蛋蛋蛋白纤维网架白纤维网架白纤维网架白纤维网架体系广义的细胞骨架包括细胞核骨体系广义的细胞骨架包括细胞核骨体系广义的细胞骨架包括细胞核骨体系广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。

架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质•狭义的细胞骨架是指狭义的细胞骨架是指狭义的细胞骨架是指狭义的细胞骨架是指细胞质骨架细胞质骨架细胞质骨架细胞质骨架，包括微丝，包括微丝，包括微丝，包括微丝（（（（microfilamentmicrofilamentmicrofilamentmicrofilament，，，，MFMFMFMF）、微管（）、微管（）、微管（）、微管（microtubulemicrotubulemicrotubulemicrotubule，，，，MTMTMTMT）、中间纤维（）、中间纤维（）、中间纤维（）、中间纤维（intermediated filamentintermediated filamentintermediated filamentintermediated filament，，，，IFIFIFIF）细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，）细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，）细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，）细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长等生命活动密切相关。

观察骨架方法？等生命活动密切相关观察骨架方法？等生命活动密切相关观察骨架方法？等生命活动密切相关观察骨架方法？3 3实实 验验 原原 理理 本实验观察由微丝平行组成的纤维束，当细本实验观察由微丝平行组成的纤维束，当细本实验观察由微丝平行组成的纤维束，当细本实验观察由微丝平行组成的纤维束，当细胞充分铺展时，经考马斯亮蓝胞充分铺展时，经考马斯亮蓝胞充分铺展时，经考马斯亮蓝胞充分铺展时，经考马斯亮蓝R250R250R250R250染色可看到沿染色可看到沿染色可看到沿染色可看到沿细胞一定方向伸展的纤维束考马斯亮蓝细胞一定方向伸展的纤维束考马斯亮蓝细胞一定方向伸展的纤维束考马斯亮蓝细胞一定方向伸展的纤维束考马斯亮蓝R250R250R250R250可可可可以染各种蛋白，并非特异染微丝，实验中用以染各种蛋白，并非特异染微丝，实验中用以染各种蛋白，并非特异染微丝，实验中用以染各种蛋白，并非特异染微丝，实验中用1%Triton X-1001%Triton X-1001%Triton X-1001%Triton X-100抽提掉胞质中的蛋白（除骨架蛋抽提掉胞质中的蛋白（除骨架蛋抽提掉胞质中的蛋白（除骨架蛋抽提掉胞质中的蛋白（除骨架蛋白外），能清楚地显示微丝束呈深兰色。

白外），能清楚地显示微丝束呈深兰色白外），能清楚地显示微丝束呈深兰色白外），能清楚地显示微丝束呈深兰色 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 MgMgMgMg2+2+2+2+ 高浓度高浓度高浓度高浓度NaNaNaNa+ + + + K K K K+ + + +诱导诱导诱导诱导 　　　　　　　　G-actin F- actinG-actin F- actinG-actin F- actinG-actin F- actin 含含含含ATP CaATP CaATP CaATP Ca2+2+2+2+ 低低低低NaNaNaNa+ + + + K K K K+ + + + 细胞骨架的观察细胞骨架的观察4 4仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂仪器：仪器：光学显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜材料：材料：植物洋葱植物洋葱植物洋葱植物洋葱每二人一套的用具每二人一套的用具每二人一套的用具每二人一套的用具: : : :平皿或试管，镊子平皿或试管，镊子平皿或试管，镊子平皿或试管，镊子 、、吸管；吸管；吸管；吸管；每人一套的用具每人一套的用具每人一套的用具每人一套的用具: : : :载玻片（为区别细胞的正反面，作个标记载玻片（为区别细胞的正反面，作个标记载玻片（为区别细胞的正反面，作个标记载玻片（为区别细胞的正反面，作个标记 ) ) ) ) 盖玻片、盖玻片、盖玻片、盖玻片、吸水纸等。

吸水纸等吸水纸等吸水纸等试剂试剂 (1) (1) (1) (1) 磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（PBSPBSPBSPBS，，，，pH pH pH pH ７７７７. . . .３），３），３），３）， (2) 0.2mol/L (2) 0.2mol/L (2) 0.2mol/L (2) 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH 6.8pH 6.8pH 6.8pH 6.8），），），）， (3) M- (3) M- (3) M- (3) M-缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液，，，， (4) 1 (4) 1 (4) 1 (4) 1％％％％Triton X-100Triton X-100Triton X-100Triton X-100（用（用（用（用M-M-M-M-缓冲液配）缓冲液配）缓冲液配）缓冲液配） (5) 0.2% (5) 0.2% (5) 0.2% (5) 0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250R250R250，，，， (6) 3.0% (6) 3.0% (6) 3.0% (6) 3.0%戊二醛（用戊二醛（用戊二醛（用戊二醛（用0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）磷酸盐缓冲液配制）磷酸盐缓冲液配制）磷酸盐缓冲液配制） 细胞骨架的观察细胞骨架的观察5 5M－缓冲液配方•咪唑（咪唑（Ph6.7Ph6.7）　　　　　）　　　　　 3.4g 3.4g•KCl 3.73gKCl 3.73g•MgClMgCl2 2·6H·6H2 2O 0.10gO 0.10g•EGTA 0.38gEGTA 0.38g•EDTAEDTA·2H·2H2 2O 0.04gO 0.04g•β β－巯基乙醇　　　　　　　　　－巯基乙醇　　　　　　　　　 70 70μlμl•甘油　　　　　　　　　　　　　甘油　　　　　　　　　　　　　 294.8ml 294.8ml•水定容　　　　　　　　　　　　水定容　　　　　　　　　　　　 1000ml 1000ml　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6 6 实实 验验 步步 骤骤 1 1 1 1）取）取）取）取PBSPBSPBSPBS液液液液4ml4ml4ml4ml培养皿中培养皿中培养皿中培养皿中, , , ,再驳取洋葱鳞茎再驳取洋葱鳞茎再驳取洋葱鳞茎再驳取洋葱鳞茎内表皮内表皮内表皮内表皮约约约约1cm1cm1cm1cm2 2 2 2若干片，若干片，若干片，若干片，放入盛有磷酸盐缓冲液的培养皿中（每二人用一个容器）。

放入盛有磷酸盐缓冲液的培养皿中（每二人用一个容器）放入盛有磷酸盐缓冲液的培养皿中（每二人用一个容器）放入盛有磷酸盐缓冲液的培养皿中（每二人用一个容器） 2 2 2 2）吸去缓冲液，用）吸去缓冲液，用）吸去缓冲液，用）吸去缓冲液，用1%TritonX-100 4ml1%TritonX-100 4ml1%TritonX-100 4ml1%TritonX-100 4ml处理洋葱表皮处理洋葱表皮处理洋葱表皮处理洋葱表皮25-40 25-40 25-40 25-40 minminminmin 3 3 3 3）除去）除去）除去）除去TritonX-100TritonX-100，，，，用用用用M-M-M-M-缓冲液充分洗缓冲液充分洗缓冲液充分洗缓冲液充分洗3 3 3 3次，每次约次，每次约次，每次约次，每次约10 min10 min10 min10 min 4 4 4 4）加）加）加）加3.0%3.0%3.0%3.0%戊二醛固定液戊二醛固定液戊二醛固定液戊二醛固定液4ml4ml4ml4ml（用（用（用（用0.2 mol/L0.2 mol/L0.2 mol/L0.2 mol/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液pH pH pH pH 6.86.86.86.8配制）配制）配制）配制） 固定固定固定固定0.5h 0.5h 0.5h 0.5h 。

5 5 5 5）用）用）用）用PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，滤纸吸去残留液体次，滤纸吸去残留液体次，滤纸吸去残留液体次，滤纸吸去残留液体 6 6 6 6））））0.2%0.2%0.2%0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250R250R250染色染色染色染色30min30min30min30min 7 7 7 7）用蒸馏水洗数遍，降低背景用蒸馏水洗数遍，降低背景用蒸馏水洗数遍，降低背景用蒸馏水洗数遍，降低背景 8 8 8 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察 9 9 9 9）结果：微丝束呈深蓝色）结果：微丝束呈深蓝色）结果：微丝束呈深蓝色）结果：微丝束呈深蓝色 细胞骨架的观察细胞骨架的观察7 7实实 验验 报报 告告 及及 思思 考考 题题1 1 画出所观察到的微丝图像。

画出所观察到的微丝图像画出所观察到的微丝图像画出所观察到的微丝图像2 2 说明在实验中说明在实验中说明在实验中说明在实验中1%TritonX-1001%TritonX-100处理细胞处理细胞处理细胞处理细胞的作用是什么？的作用是什么？的作用是什么？的作用是什么？3 3 说明说明说明说明M-M-缓冲液的作用是什么？缓冲液的作用是什么？缓冲液的作用是什么？缓冲液的作用是什么？ 细胞骨架的观察细胞骨架的观察8 8    光镜下显示细胞骨架：光镜下显示细胞骨架： 红色显示微丝，绿色显示微管红色显示微丝，绿色显示微管                  9 910102.植物组织培养植物组织培养ⅢⅢ:外植体的培养诱导与观察外植体的培养诱导与观察下次实验：下次实验：1.小鼠骨髓染色体的制备观察小鼠骨髓染色体的制备观察1111。