黄酮标准曲线绘制的实验报告(共12页).doc

精选优质文档-----倾情为你奉上黄酮标准曲线绘制的实验报告1.总黄酮的测定1.1 实验仪器电子天平AR2140;紫外可见分光光度计UV2754;型数控超声波清洗器KQ3200DB;超级恒温槽;Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ; FD21C250 冷冻干燥机2 1.2 试剂及药品芦丁 标准品硝酸铝 国产分析纯（配成5 %）亚硝酸钠 国产分析纯（配成10 %）氢氧化钠 国产分析纯配成（配成1mol/L）95%乙醇，无水乙醇 国产分析纯（配成60%乙醇 50%乙醇）DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）没食子酸对照品：基准纯大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔 1.3实验步骤： 1.3.1准备工作及波长的确定样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大 1.3.2参照品芦丁标准溶液的制备精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。

1.3.3标准品的测量及绘制标准曲线精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度线得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）以试剂空白做参比）以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2序号浓度（ug/ml）吸光度1002150.180 3300.349 4450.546 5600.727 6750.884 7901.063 表1-1： 芦丁标准曲线测定数据图1-2：芦丁标准曲线1.3.5样品的测试根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大取黄酮提取液， 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。

取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值经换算后得样品中总黄酮含量样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)式中：X—测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算n—稀释倍数，量纲为1;VI—样液总体积，mL;V—测定时取样体积，mL;W—样品质量，g2.总分含量的测定 2.1 实验仪器ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管管(10mL);烧杯、移液管、吸耳球2.2试剂及药品没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真空中干燥4 h。

乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯2.3 Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量 3.3.1 Folin—Ciocalteu试剂的配制称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85％的磷酸溶液和20 ml浓盐酸，文火回流10 h，然后加入3 g硫酸锂及15 ml双氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色冷却，移入250 ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存 2.3.2对照品溶液制备准确称取15．00 mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度振荡一下，静置2h(Guo&Wei,2011)。

同时制作空白管为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管于765 nm波长处测定吸光度值 2.3.3标准曲线的制备以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2序号浓度（ug/ml）吸光度（WL765.0）000130.132260.284390.4114120.5825150.7126180.8437211.013 表3-1：没食子酸标准曲线测定数据图3-1：没食子酸标准曲线 2.3.4样品的测定 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度振荡一下，静置2h同时制作空白管为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管于765 nm波长处测定吸光度值总酚酸含量计算：多酚含量（mg/100g）= 3.清除 DPPH的能力的测定3.1.实验仪器、药品及试剂 2.1.1 实验仪器ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管(10mL);烧杯、移液管、吸耳球。

3.1.2试剂及药品DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）；Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）为分析纯；无水乙醇，蒸馏水 3.2.1配制DPPH溶液 配制0.06mMDPPH试剂，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用 3.2.2参照品Vc标准溶液的制备 准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值(Thoo&Ho,2010)，用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组 清除率=[(Ac-Ai)/Ac]100%式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL DPPH 溶液的吸光度；Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLDPPH 溶液的吸光度。

3.2.3标准曲线的绘制3.2.2测试数据及标准曲线的绘制序号C（mmol/L）吸光度清除率/%00010.20.52914.92 20.40.42430.90 30.60.3246.73 40.80.20963.62 510.1178.69 61.20.0292.39 表3-1：VC标准曲线测定数据以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2图3-1：VC含量与吸光度的关系图3-1：VC含量与清除率的关系 3.2.4样品的测定 取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释2.5倍取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL 试管中，再分别加入配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc为参比）,三次结果取平均值经换算后得样品自由基清除率4. 清除ABTS+自由基能力的测定4.1ABTS+自由基的配制准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h，形成 ABTS+ 自由基储备液。

该储备液在室温，避光的条件下稳定用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm处测得其吸光度为0.7000（0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用4.2标准曲线的绘制4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试 准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2011)，用无水乙醇作空白，重复三组 清除率=[(Ac-Ai)/Ac]100%式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度；Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。

4.2.2测试数据及标准曲线的绘制序号C（mmol/l）吸光度清除率/%100.00 20.10.5712.04 30.20.49323.92 40.30.42234.88 50.40.35145.83 60。