PCR技术包含引物设计样本.docx

聚合酶链式反应（ＰCR）DNA的半保留复制时,双链DNＡ在多种酶的作用下能够变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则　复制成同样的两分子挎贝在实验条件下,DNＡ在高温时也能够发生变性解链,当温度降低后又能够复性成为双链因此,经过温度变化控制ＤNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DＮＡ聚合酶、ｄNTＰ就能够完成特定基因的体外复制ＰCR类似于DＮA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物」PCR由变性-退火（复性）－延俾三个基本反应步骤构成：① 模板DNA的变隆模板DＮA经加热至９４C左右一定时间后,使　模板DNA双链或经ＰCＲ扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性>模板DＮＡ经加热变性成单链后,温度降至40~60C左右,引物与模板ＤNA单链的互补序列配对结引物的延伸：DＮA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于７２Ｃ左右,以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板ＤNA链互补的半保留复制链.　重复循环就可获得更多的”半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需２一4分钟,2一3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍1) ＰCＲ技术分类（常见)反向PCR技术（Invｅrse　ＰCR,ＩPCR)：反向PCR是克隆己知序列旁侧序列的一种方法.主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DＮA.后酶切片段自身环化.以环化的ＤNA作为模板,用一对与己知序列两端特异性结合的引物,扩增夹　在中间的未知序列该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布　情况用不同的限制性内切酶消化，能够得到大小不同的模板DNA,再经过反向ＰCＲ获得未知片段2) 锚定PＣR技术（Aｎcｈｏred　PCR,AＰCR):用酶法在一通用引物反转录CDNA3，－末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDＮＡ进行扩增，称为APCRO不对称ＰCR技术（asyｍmetｒicPＣR):两种引物浓度比例相差较大的PCＲ技术称不对称ＰCRO在扩增循环中引入不同的引物浓度，常见50一１00+１比例在最初的10一15个循环中主要产物还是双链DNＡ,但当低浓度弓|物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNAｏ反转录ＰCR技术（reversetranscriｐｔiｏnＰCR,RＴ-PCＲ):当扩增模板为RNA时，需先经过反转录酶将其反转录为cＤＮ&才能进行扩增。

应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检验等都经常采　用3) 巢式PCＲ技术(NＥＳＴ-ＰCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的ＰＣＲ带,此为巢式ＰＣR若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PＣR为减少巢式PCR的操作步骤可将夕卜弓物设计得比内弓物长些,且用量较少,同时在第一次PCＲ时采用较高的退火温度而第二次采用较　低的退火温度，这样在第一次ＰCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物，经过若干次循环,待外引　物基本消耗尽,无需取出第一次PCＲ产物，只需降低退火即可直接　进行PＣR扩增这不但减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会这种PＣＲ称中途进退式PCR,主要用于极少量DＮA模板的扩增4) 多重PＣＲ技术(multiplexPCR)：在同一反应中用多组引物同时　扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失，则相应的电泳谱上这一区带就会消失主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断5) 重组PCR技术:重组ＰCＲ技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其５，-端和３,-端引物上带上一段互补ﻬ的序列,混合两种ＰＣR扩增产物，经变性和复性,两组PCＲ产物互补序列发生粘连，其中一条重组杂合链能在ＰCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

6) 原位ＰＣＲ技术:利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测　手段来检测细胞内的扩增产物直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列荧光定量实时PCR技术反应动力臣PＣR的三个反应步骤重复进行,使DNA扩增量呈指数上升,最终DNA扩增量可用Y=（l＋Ｘ)n计算,Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率,n表示循环次数平均扩增效率撞论值为10０％，但实际情况达不到，反应初期靶序列DＮA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不此效应廊平台期|,与ＤNＡ聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期,即出现"停滞效应”ＰＣR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链５，端之间，是需要扩增的特定片段短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原攵台模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3,端开始延伸，其５,端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是长产物片段。

进入第二个反应周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(长产物片段）结合引物在与新　链结合时，由于新链模板的5,端序列是固定的，故这次延伸的片段３,端被固定了止点,保证了新片段的起点、止点都限定于引物　扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计,使得PCR的反应产物不需再纯化既能够保证足璃纯的ＤNA片段供分析、监测① 反应五要素…引物、模板、DNＡ聚合酶、四种dNTP、Ｍg2+引物设计引物长度:１5－30ｂp,常见为20bｐ左右② 引物扩增跨度：以2００-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段③ 引物碱基:Ｇ+Ｃ含量以40-6０%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C辿多易出现非特异条带ATGＣ最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性引物的GC含量和Tm值应该协调:Ｔm＝4(G＋Ｃ)+2(A＋T)】避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是３,端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带④ 引物３,端为关键碱基，是PCR延伸的起始端,不能进行任何修　即，也不能形成二级结构的可能，一般３'端也不能发生错配,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PＣR失败。

"无严格限制，只起限定PＣR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大,因此常见来引进修筋位点或标记物⑤ 引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处⑥ 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑦ 引物量：每条引物的浓度0．1一lumｏl或10—lOOpmｏl，以最低引　物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会1) ＤNA聚合酶:当前有两种TａqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶催　化一典型的PＣＲ反应约需酶量0.5-2.5Ｕ/50　ml,浓度过高可引起非　特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少(2) dNTP的质量与浓度：ｄNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度　后,以IＭ　NａOＨ或IMTｒiｓ-HCL的缓冲液将其PＨ调节到7．0—　7.5,小量分装，－20Ｃ冰冻保存多次冻融会使dNTＰ降解在PCR反应中,dNTＰ应为50—2０0umol／Ｌ，特别是注意４种dNＴP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。

浓度过低又会降低PＣＲ产物的产量模板(靶基因）核酸:模板核酸的量与纯化程度，是PＣＲ成败与否的关键环节之一，传统的ＤNA纯化方法一般采用SDＳ和蛋白酶K来消化处理标本SＤS的主要功能是：溶解细胞上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白,ＳDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶Ｋ能水解消化蛋白质,特别是与DＮA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于ＰCR反应3) Mg2+浓度:Ｍｇ2+对ＰCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的ＰCR反应中，各种ｄNTＰ浓度为2０0umoｌ/L时,Mg2＋浓度　为1.5一2.０mmol／L为宜Ｍｇ2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增，浓度朔氐会降低Taq　DＮＡ聚合酶的活性，使反应产物减少RT-PCR　-是将ＲNA的反转录(RT)和ｃDＮＡ的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术总RNＡ提取（-70C保存）Trizol法:1、取组织100mg于玻璃匀浆器中,加入１mlTｒizol冰上抽打匀浆(边匀浆边暂停)2、移入1．5ｍlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、ﻩ加氯仿0.2ｍl（总体积的1/５),振荡混合,室温放置5mｉn4、4C，离心1rpm，15mｉｎ５、ﻩ取上层液相（约400n1）移入一新１.５mlEP管中,加等体积异丙　醇（约4０0“1），振荡混合,室温保存lOｍｉn６、4C,离心1rｐｍ,lOｍin7、弃上清液，加1ｍl７５％无水乙醇（4C保存),振荡混合8、4C,离心7500rpm,5mｉn9、ﻩ弃上清液，室温放置20min（EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加2０ｕlＤEPC水至EP管中,在60C孵育3-5mｉｎ（或手握3－5min),使RＮＡ充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱－70Ｃ)测RNA浓度:走RNA变性电泳观察18ｓ、28s条带,分光光度计检　测260/280吸光度比值调零:750ｕｌＤEPC水测量:7４5uｌＤEPC水+5ulＲＮA总RNA浓度＝OD２6０x40ｘ稀释倍数(15０倍）uｇ/ｍl=OD2６0x40xｌ50ug/ml=OD260x６ug/ｕlA1/Ａ2应在1.8-2.0之间注意:提取ＲNA的质量主要是要经过26０/280的比值看是不是在2．0左右,当OD260/OD２８0<１．8时提示有蛋白或酚的污染,需要进一步纯化ＲNA;还要跑胶看看28ｓ、１8s、5ｓ的三条带是不是清晰,—般质量好的RNA,　28ｓ:18s的亮度比例在２:1左右,最后一条５s　的应该比较淡。

逆转录RT(ｃＤＮＡ:一周内-2０C保存,长期－7０C保存）ＲT反应体系：2０uｌ体系第一步:约２0分钟ＲNA抽提物ﻩ５“1Raｄｏme引物2“1RNＡｓin0.5｜１1１、65C15分钟２、ﻩ立即放入冰浴第二步:约2小时RNAｓiｎ0．5|11lOｎiMdＮＴＰＩgｌ5xＲT缓冲液４〃125ｍＭMgC124｜11AＭVﻩ3　ｐl1、ﻩ３7C1.5小时2、ﻩ9４C５-1０分钟3、ﻩ反应物保存于-20C或进行PCR聚合酶链反应ＰCR(产物-２0Ｃ保存)PCR反应体系：１00“1体系约４.5小时约５小时25111ＭＭgC12　２）．11ﻩ3pl10xPCR缓冲液lOniＭdNTＰﻩIplＩgｌｌＯpｍoｌ/妇上游引物ﻩ2.５　“12.5“１lOｐmoｌ/妇下游引物ﻩ２．5“1２.5　“1ｃDＮＡ模板２.5ｎ　1５“1ｄｄH2０3４|１13０）11Taq酶0．５　“１１/11轻质石蜡油50“15０“11、94C2分钟,５５C1分钟,７2C2分钟为第一个步1个循环２。