real_timePCR与引物设计说明.ppt

PCR引物设计、RNA提取 与Real Time PCR 冀伟 PCR引物设计原则 如何设计PCR引物  RNA提取  Real-time PCR PCR引物设计的重要性 用得较多的引物设计软件有：用得较多的引物设计软件有： OligoOligo 6.0 6.0 ( ( demo version) demo version) Primer premier 4.11Primer premier 4.11 ( (wwwwww．．P P demo version) demo version) 引物在PCR反应中处于关键作用而在目前 DNA的化学合成技术非常成熟的情形下，引 物设计是否合适是我们应更为关注的层面 v引物决定着扩增的特异性和扩增的效率 v引物设计影响到后续载体构建的效率 v引物设计影响到实验的成本 PCR引物的寡核苷酸数（长度） § 一般在16～30个核苷酸（NT） § 至少为16个核苷酸 § 最好为20～24个核苷酸 以上指与模板链完全配对的碱基数 问题： 1) 太短，特异性差； 2) 太长，自身折叠形成二级结构；Tm过高， 不利于与模板稳固配对，难以形成扩增起始 二级结构。

引物的碱基组成 GC为40～60％ ATGC最好随机分布 问题： 1) GC％太低扩增效果不佳 2) GC过多易出现非特异条带 3) 避免成串的嘌呤和嘧啶 引物的Tm值 主要考虑的因素有：主要考虑的因素有： I I 反应体系对引物退火温度的影响如酶的最适 工作温度对引物退火温度的限制等 q 太低，引物与模板非特异结合，出现非特异扩增条带 q 太高，引物与模板结合不牢固，无扩增 扩增特异基因，Tm一般选40～60℃ 如何用软件设计PCR引物 1. 在NCBI核酸序列数据库中获得待设计引物的基因序列（gDNA）及表达 序列（CDS序列） 2. 根据gDNA及CDS序列，明确CDS序列中内含子的确切位置（如果表达载 体构建，则只需要明确编码序列中起始密码子（ATG）与终止密码子 (TAA/TAG/TGA)的位置即可） 3. 根据Real time -PCR引物设计原则，用Oligo 6.0 软件设计跨内含子引物 （1）序列导入 （2）根据需要修改待设计引物长度 （3）根据引物设计原则，肉眼选择合适引物 （4）评估引物 Oligo 6.0引物软件的操作使用 1.序列输入 File菜单→New sequence →粘贴序列（CDS 序列、mRNA序列、DNA序列） Oligo 6.0引物软件的操作使用 2.根据需要修改待设计引物长度 Change菜单→Current Oligo legth→修改引 物长度（17-25nt） Oligo 6.0引物软件的操作使用 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对 的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。

引物3′ 端的△G 值过高， 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应 3.根据引物设计原则，肉眼选择合适引物 1. △G值：5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值 较低（绝对值不超过9）的引物 2. Tm：40～60℃，上下游引物之间的Tm差距越小越 好 3. Frq：错误互补配对的频率；1000, 越小越好 注：该软件给 出的Tm 比实际 值高出10 ℃ 4. 评估引物  Tm、GC%、上下游引物Tm的差距、PCR产物 扩增长度 引物形成二聚体的情况 引物发卡结构形成的情况 正确互补配对引发效率和错误互补配对引发 效率 Tm、GC%、上下游引物Tm的差距、PCR产物扩增长度 4. 评估引物 上游引物自身形成二聚体的情况 下游引物自身形成二聚体的情况 上下游引物自之间形成二聚体的情况 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G 值不要过高（应小于4.5kcal/mol）否则易导致产生引物 二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进 行 上游引物发卡结构形成的情况 下游引物发卡结构形成的情况 Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3 个 oligo会给我正确引发效 率和错误引发效率，一 般的原则要使误引发效 率在100以下，当然有时 候正确位点的引发效率 很高的话，如达到400～ 500，错误引发效率超过 100幅度若不大的话，也 可以接受。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 5. 引物特异性比对-输入引物序列 5. 引物特异性比对-选择物种 对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没 有交叉的其他基因的同源序列就可以 5.引物特异性比对-分析比对结果 RNA提取成败之关键 1. RNA提取试剂盒选择 原则：根据样品种类（细胞或组织）、取材难度而定 QIAGEN、Invitrogen、Omega、Takara、北京天根、全式金 2. 研磨方法选择 原则：根据样品种类（细胞或组织） 3. 病例或病理组织样品保存 原则：A. 取材容易，现取现用 B. 取材不易，先液氮，后超低温（-80℃）保存 4. RNA提取准备工作 1）RNA提取环境：超净工作台 2）试剂准备：0.1%DEPC水（已121 ℃高温高压灭 菌至少50min）配制的3%过氧化氢或0.5 Mol/L 氢 氧化钠及75%酒精（用没有开封过的无水乙醇配 制）、 已灭菌0.1%DEPC水配制的核酸电泳TBE缓 冲液，其他试剂（均为未开封，或RNA提取专用 ） 3）器材准备：移液枪、PE手套或橡胶手套、废液瓶、 无RNA酶的EP管、PCR管、枪头；量筒等玻璃器皿（ 150-180 ℃ 高温干热灭菌5-8小时）。

4）杜绝RNA污染及降解的准备工作：依次用0.1%DEPC 水配制的3%过氧化氢或0.5 Mol/L 氢氧化钠及75%酒 精擦拭台面、移液枪、未开封PE手套及均未做过无 RNA酶处理物品（如离心管架）的外表面 5）操作手法 a. 混匀操作：如果液体体积在100ul以内，用指头弹击管 底混匀；在100-400ul之间，用振荡器混匀；大于400ul， 用手晃动混匀：晃动时使离心管底永远处于斜上位置， 频率要快 b. 上清移取： 离心管倾斜，根据上清的量选择不超过 200ul的移液器，在离心管外先压下移液枪，再将枪头移 入上清枪头尖尽可能靠近液面，枪头尖嘴接触内壁， 缓慢松手移取上清，可多次移取，并且留下1mm以上的 液体不要吸取不可用1mL移液枪吸取上清 c. 整个RNA提取及反转录过程勤换PE手套（每研磨或裂 解一个样品换一次手套，每隔一个步骤也需换一次手套 ） 谢谢！欢迎各位 老师、同学提问 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview 。