基因工程抗体.docx

基因工程抗体生命科学学院 09 动物医学学号：2009082554 姓名：张孝辉 指导老师：郑新添【摘要】：基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等)正逐渐取代动物源性 单抗随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体 的种类日趋多样化,构建日趋合理化,在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范 围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景关键词】：基因工程抗体;生物技术【前言】：单抗作为一种有效的新型生物制剂促进了基础医学、临床医学、生物学、农学等众多生命 学科的发展, 尤其在疾病的预防、诊断及治疗方面的作用日益重要然而作为体内的应用, 啮齿类动物单抗 的高免疫原性，使所有病人均发生不同程度的人抗鼠抗体反应(HAMA),削弱了治疗的有效性，并对清除抗体 的器官产生毒性损害, 因此其应用严重受限 为了创造出更理想的治疗用抗体分子, 将制备单抗的细胞工程 技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合,产生了基因工程抗体短短的几年研究使 得这个领域的发展日新月异, 目前已成为抗体应用研究的热点。

但随着研究的深入进展, 也暴露出许多问 题目前在以单抗为基础的临床治疗研究中, 面临五个最重要的问题及技术挑战:(1) 使基因工程抗体具有与亲本抗体相一致的亲和力及特异性;(2) 克服人抗动物单抗及人抗任何与单抗相交联的细胞毒性物质的免疫反应;(3) 制备合适的细胞毒性物质;(4) 符合体内药物动力学及生物分布特性;(5) 高产量,低成本本文综述了近几年国内外学者为攻克这几个难题在基因工程抗体领域所做的努力及 研究进展1.基因工程抗体概述基因工程抗体又称重组抗体, 是指利用重组 DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按 不同需要进行加工改造和重新装配, 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子目前报道的 基因工程抗体很多, 分类方法不一, 大体可以分为三类1.1 完整的抗体分子该类抗体类似于天然抗体分子, 但经改造后更接近于人的免疫球蛋白, 可在一定程度上 降低 HAMA1.1.1 嵌合抗体(chimeric antibody):由在基因水平上连接的小鼠抗体V区及人抗体C区组成这种抗体含75%〜80%人抗体, 20%鼠抗体, 保留了原来鼠源单抗的特异性, 但对人体仍具一定的免疫原性1.1.2人源化抗体(humanized ant ibody)又称重构型抗体、改型抗体(reshaped ant ibody)或 CDR 移植抗体(CDR grafting antibody):通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区(又称互补决定区,CDR),使构成抗原结合部位的 轻重链各 3 个 CDR 区是鼠源的, 其余均为人源的。

该抗体对人的免疫原性大大降低, 但与 抗原的亲和力也有所下降虽然目前通过选择与鼠单抗同源性大的抗体及改变骨架(fragment region, Fr)上某些关键的氨基酸残基或遮蔽鼠单抗CDR表面的残基(veneering)等方法， 人源化抗体与抗原的亲和力只能达到原先鼠源单抗的33%〜 35%而且杂交瘤技术使人们可 能在稳定的细胞株中生产任何一种单抗，该技术已广泛应用于科研及临床诊治中鼠单抗作 为异源性蛋白在人体内可诱发抗鼠抗体(HAMA)的产生(Elliott等，1994)，而通过杂交 瘤技术获取人单抗，技术上还存在诸多问题，为解决这一难题，鼠单抗人源化成为最早出现 的基 因工程抗体(Vaughan等，1998)1.1.3 完整的人抗体(fully human ant ibody):这是由人淋巴细胞产生的理想的抗体分子, 不包含任何鼠源成分此种抗体不仅完全避 免了 HAMA 的产生, 而且特异性、亲和力不受影响尽管利用人细胞制备单抗的工艺尚不成 熟, 但抗体库技术、体外亲和力成熟及转基因动物的研究等, 已使生产完整的人抗体成为可 能 【1】1.2 抗体分子片段小分子抗体片段具有免疫原性低, 分子量小, 易于渗入目标组织及清除, 不与 Fc 受体 阳性细胞相结合等优点, 并便于发展其他效应, 如与毒素相连, 融合表达免疫毒素; 与放射 性同位素相连, 在体内成像定位检查时本底低, 能呈现清晰图像。

1.2.1 单区抗体又称单域抗体:由单个VH功能区构成，制备方法简便但亲和力较完整抗体下降了一个数量级，另外 VH暴露了原先和VL结合的疏水性表面，影响了其特异性因此如果要应用VH仍需进一步改 造 【2】1.2.2单链抗体:由 VH 和 VL 中间联以含 14〜 15 个氨基酸残基的小肽, 较稳定, 但亲和力比完整抗体 及 Fab 低, 可能与肽连接物干扰有关除此之外, 一些 scFv 有很强的聚集趋势因此, 双 价、三价 scFv 应运而生研究表明, 多价 scFv 在结构和功能上更接近亲本抗体, 与抗原 结合比单价 scFv 更敏感, 亲和力更高, 几乎与亲本抗体结合抗原的功能一致 1.2.3二硫键稳定的Fv链内二硫键通过联结 VH 和 VL 功能区中结构上固定的骨架区使 VH 和 VL 成为一体这 种方法适用于任何 Fv, 因为用来连接二硫键的残基位于结构上固定的骨架区, 链内二硫键远 离 CDRs, 不干扰抗体与抗原结合因此与 scFv 相比 ,dsFv 更具稳定性及亲和性1.2.4 Fab 和嵌合 Fab:Fab包括重链的VH2CH1和轻链的VL2CL,如果CH1和CL是人源的，就为嵌合Fab。

Fab 由于两条链间的非极性相互作用, 很稳定, 而且因为有 CH1 便于检测基因工程菌表达 的 Fab 与酶解获得的 Fab 具相同的功能它的表达有时会比 scFv 低, 可能与两条链在细菌 周质中的折叠有关, 但亲和力比 scFv 好, 几乎与亲本抗体一致1.2.5 分子识别单位(molecular recog nit io n unit ,MRU ):一种肽或非肽类分子, 表达一个 CDR, 可能模拟亲本分子的特异性有一些模拟抗体的 肽类似物已被合成, 并证明能阻断病毒与细胞的结合;只构建并合成了一例非肽类分子, 完全 消除了抗体对人的免疫原性 MRU 分子量小, 在药物动力学、生物分布尤其是组织穿透性、 用药规则等方面具优越性, 可能成为显像分子及打靶分子中很重要的一部分不过 MRU 是否 具有同Fab及Fv片段一样的亲和力还有待于进一步证实3】1.3 新型抗体分子将抗体的部分片段连接到与抗体无关的序列上或被其他功能性分子所取代, 使这些抗体 不仅具有与抗原结合的特性, 还能发挥其他效应1.3.1 抗体相关分子又称新效能抗体:通过基因拼接、化学交联等方法, 使不同类型抗体分子与酶、化学药物、放射性同位 素、生物毒素、超抗原 等相结合。

抗体发挥导向及载体效应, 使所连接物质准确无误地聚集 于靶组织, 具有特异性高、用量少、副作用小的优点1 . 3. 2双特异性抗体又称双功能抗体:这种抗体的两个 Fab 段能同时与两个不同的抗原相结合, 如与特异性抗原及效应细胞相 结合可通过化学交联、二硫键交换连接两种特异性不同的抗体或通过两种杂交瘤细胞融合 而制备还有人报道用逆转录病毒衍生的穿梭载体进行基因转移来生产1.3.3 催化抗体(catalytic ant ibody)又称抗体酶(abzyme):指具有催化活性的抗体, 不仅能与抗原结合, 还能使他们发生化学转变这些抗体明显 的作用是选择性结合并降解病毒、肿瘤细胞及其他生理靶细胞表面表达的蛋白质及碳水化合 物抗原 此外, 催化抗体还参与药物、化学制剂、新物质的合成, 并能为基本化学反应提供 理论依据例如转换态稳定、酸2碱反应及亲电、亲核反应的催化自从第一例与酯类水解 有关的转换态类似物的催化抗体的研制成功, 已建立了许多方法以提高催化抗体的反应性 , 包括蛋白质工程的应用及协同因子结合位点的设计等 最近, 还有人报道用抗体库制备出切 割各种核酸的抗体酶表面表达的噬菌体抗体库也为催化抗体的生产及临床诊断、治疗方面 的发展提供了一条可行的途径。

【4】2 基因工程抗体生产技术2.1 常规技术提取杂交瘤细胞DNA、总RNA及mRNA,构建基因组文库或cDNA文库，利用抗体“共同 引物” (consensus primer)及逆转录PCR技术扩增、克隆出所需抗体基因，重组入原核或真 核表达载体中, 在原核或真核系统中表达原核宿主细胞表达成本低, 可大量生产, 目前 E. coli 系统应用最多然而原核细胞不能进行翻译后的加工, 如二硫键的精确形成和糖基化, 而这些加工对维持抗体的正确折叠, 保持抗体的结构与功能具有重要的作用因此, 应用真核 系统表达抗体基因有一定意义【5】现今用于表达抗体基因的真核细胞多为骨髓瘤细胞, 这类 细胞表达产量高, 具良好的生物学活性, 但有无致癌潜能尚待深入研究, 因此用昆虫 、植物 细胞、酵母等表达抗体基因的报道并不鲜见但真核细胞转染困难、效率不高、产量有限2.2 抗体库技术即用细菌克隆取代B细胞克隆来表达抗体谱(repertoire)主要步骤如下：(1) 从免疫或未免疫的 B 细胞中分离抗体可变区基因;(2) PCR 扩增抗体基因片段, 随机克隆入相应载体, 从而形成组合文库;(3) 转化细菌, 表达产物通过多轮抗原亲和吸附, 最终筛选出所需抗体并大量生产。

表面 表达的噬菌体抗体库 是此项技术的一个突破性进展在丝状噬菌体(M 13、Fd)外壳蛋白基因 的信号肽序列与编码成熟蛋白序列之间插入外源基因, 并不影响其表达系统外源蛋白融合 表达在噬菌体外壳蛋白的 N 端, 可以自发折叠成天然状态, 具有其生物活性, 不形成包涵 体它在筛选时检测的不是细菌克隆的可溶性表达产物, 而是噬菌体载体转化细菌后, 融合 表达在噬菌体颗粒表面上的噬菌体抗体通过多轮抗原吸附 22 洗脱 22 扩增, 最终筛选到所 需的抗体克隆, 大大简化了筛选过程 【6】抗体库技术较杂交瘤技术筛选范围缩小、时间缩 短, 而且获得的是人源的抗体, 但要获得高亲和力抗体, 还需建立在免疫人体的基础上, 这 对某些抗原来说有很大限制2.3 体外亲和力成熟抗体应答过程中二次应答抗体的亲和力显著高于初次应答的抗体, 此为亲和力成熟现 象抗体库技术不包括引发突变的过程在内, 而多次免疫人体有很大限制, 因而模拟体内过 程, 在体外诱发突变成为获得高亲和力的一条途径目前主要的方法为定点突变(替换关键部 位的氨基酸) 和随机突变(先造成大量随机突变, 再经抗原选择), 避开了免疫人体的限制, 同 时其多样性也为难于筛选到的单抗如催化抗体提供了可能。

随机合成库工作量繁重为其不足 之处2.4 转基因动物以人的免疫球蛋白(Ig)基因组取代动物Ig基因组，用相应抗原免疫动物后获得的即为 人抗体我国学者应用基因敲除和取代的方法 , 创建了产生嵌合抗体的小鼠, 经抗原免疫后, 产生的特异性嵌合抗体在血清中的滴度和亲和力无异于野生型小鼠国外学者 在小鼠 B 细 胞内导入大片段 DNA， 并进行 V (D)J 重排， 表达在 B 细胞表面， 经抗原免疫后发生高突变 并表现亲和力成熟和 Ig 类别转换， 产生完整的人抗体美国 BM S 公司和 GT 公司正致力于 转基因山羊的研究这种羊分泌的乳汁中含大量 BR96 单抗(抗 Le 相关糖类抗原单抗)， 可望 用于结肠癌、乳腺癌及肺癌的治疗转基因动物是生产人抗体最理想的方法, 但技术难度较 大, 超出了目前的水平只有大片段的基因组工程包括转基因动物技术的改进, 才能真正得 到突破【7】3.基因工程抗体的临床研究3.1。