石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步研究.doc

1石斛属植物 rbcL 基因序列变异和系统发育初步研究【摘要】 目的探讨 10 种石斛植物叶绿体 rbcL 基因序列变异和系统发育关系方法根据 Genebank 已经公布的植物 rbcL 基因序列设计一对引物，用于石斛 rbcL 基因 PCR 扩增基因序列排列用Clustal X 软件完成，应用 Seqnconverter 软件分析序列的长度、GC 含量、GpC 量、GCskew 值等；用 Mega 4.1 软件分析转换值、颠换值、转换/颠换比；采用最大简约法（ maximum parsimony method）获得最大简约系统树；应用自展法（bootstrap ）检验系统树，自展次数为 1 000 次结果 10 种石斛植物叶绿体 rbcL 基因的长度范围为 944～950 bp，其中 536 bp 为保守位点，466 bp为变异位点，439 bp 为具有系统发育信息的信息位点基因中 GC含量为 40.61%～41.37%，GpC 含量为 4.03%～4.78%，GCskew 值为 0.043 2～0.082 1序列转换/颠换比（Si/Sv）为 0.9结论利用 PCR 和核酸测序方法可以获得 rbcL 基因的核苷酸序列，能为石斛植物的系统发育研究提供核苷酸序列方面的资料。

【关键词】 石斛；rbcL 基因；序列分析；系统发育Abstract：ObjectiveTo explore the sequence variation of rbcL Gene and Phylogenetic relationship of Dendrobium 2plants. MethodsA pair of primers was designed to amplify the rbcL gene. Gene sequence, the contents of G+C, the contents of GpC, the value of GCskew, transitionsal pairs, transversional pairs and si/sv were conducted. Phylogenetic analysis was conducted using the maximum - parsimony (MP) method. Bootstrap analysis were carried out to evaluate statistical reliability based on 1000 resamplings of the data set. Results944～950 bp nucleotides were sequenced in the chloroplast rbcL gene from Dendrobium plants. Conserved sites, variable sites and phylogenetically informative sites were 536 bp, 466 bp, 439 bp respectively. The contents of GC, the contents of GpC, the value of GC skew and transitionsal pairs/transversional pairs were 40.61%～41.37%, 4.03%～4.78%, 0.043 2～0.082 1 and 0.9 respectively. ConclusionThis paper offers DNA sequence data for the study of Dendrobium phylogeny.Key words：Dendrobium; rbcL gene; Sequence analysis; Phylogeny石斛是我国传统贵重中药材，现代药理研究证明其具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、治疗白内障等作用［1］ 。

由于石斛属植物3集药用和观赏于一体，被过度地开发利用，加上生境的破坏及自身生长缓慢等原因，石斛野生资源濒于绝灭迄今为止，石斛属植物的研究已在形态学、比较解剖、植物化学、同工酶和等位酶等方面积累了许多资料［2， 3］ 运用 PCR 和 DNA 测序等方法，从分子系统学角度对石斛进行研究也有一些报道，所选择的基因包括matK 基因［4］和 rRNA 基因［5］ l，5-二磷酸核酮糖羧化酶/ 加氧酶（Rubisco）是一种具有羧化和加氧双重功能的酶，在光合作用和光呼吸中都起着重要作用Rubisco 酶由 15 个亚基组成，包括 8 个大亚基和 8 个小亚基其中大亚基基因（ rbcL）由叶绿体基因组编码，小亚基基因（rbcS）由核基因组编码，其中 rbcL 基因已经成为分子系统学研究中使用最为广泛的分子指标之一为此，本文尝试对 10 种石斛植物 rbcL 基因进行测序并分析，旨在为研究石斛植物的系统发育提供核苷酸序列方面的证据1 材料实验所用石斛植物采自云南的原始森林，现被整丛栽种于山东理工大学生命科学学院植物组织培养实验室以便及时取材和观察见表 12 方法42.1 总 DNA 的提取取各样品新鲜原植物的叶片，采用改良的 CTAB 法提取基因组 DNA［6］ ，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，并在紫外分光光度计下检测其浓度，稀释标定到 10 ng/μl，放入-20℃冰箱里储存备用。

2.2 rbcL-PCR 反应体系PCR 反应在 PTC-200 型梯度热循环仪上进行， PCR 扩增反应总体积为 50 μl，其中包括 50 mmol/L KCl，10 mmol/L TrisHCl (pH 9.0)，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，50～100 ng 基因组 DNA，1U Taq 聚合酶和 0.1 μmol/L引物根据 Genebank 上已经公布的植物 rbcL 基因序列设计一对引物，用于 rbcL 基因片段 PCR 扩增，其中上游引物 P1 为：5′-GAG AGA CTA AAG CAA GTG TTG GA-3′，下游引物 P2 为：5′-ATG ATC TCC ACC AGA CAT ACG A-3′引物由上海生工生物技术有限公司合成，PCR 扩增程序为 94℃变性 3 min；94℃ 50s，56℃1 min，72℃1 min，循环 35 次，72℃延伸 10 min扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，用 Alpha 2200 凝胶成像系统观察结果52.3 PCR 产物的纯化与测序使用上海生工公司柱式 DNA 胶回收试剂盒进行回收，由博尚生物技术有限公司测序，测序引物与 PCR 反应引物相同。

2.4 数据处理基因序列用 Clustal X 软件排列，应用 Seqnconverter 软件分析序列的长度、GC 含量、GpC 量、GCskew 值等；用 Mega 4.1 分析转换值、颠换值、转换 /颠换比；采用最大简约法（maximum parsimony method）获得最大简约系统树；应用自展法（bootstrap）检验系统树，自展次数为 1 000 次表 1 实验材料来源及采集地（略）3 结果3.1 石斛 rbcL 基因序列分析利用 Seqnconverter 分析软件对 10 种石斛材料进行长度、GC 含量、GpC 量、GCskew 等分析（见表 2） 10 种石斛叶绿体基因 rbcL 的长度大约为 944～950 bp(图 1） ，其中 536 bp 为保守位点，466 bp 为变异位点，439 bp 为具有系统发育信息的信息位点基因中 GC 含量约为 40.61%～41.37%，GpC 含量为64.03%～4.78%，GCskew 值 0.043 2～0.082 1GpC 甲基化程度影响基因的表达水平，GC skew 值显示 GC 分布的非对称性大小，值越小说明基因中碱基高分布对称性高，表明 rbcL 基因在自然进化过程中变异性较低。

基因序列平均转换/颠换比（ Si/Sv）为 0.9，小于临界值 2，说明 rbcL 基因很保守，适合用于分子系统发育方面的研究，同时可以利用不同植物间相同基因的差异性进行品种鉴定表 2 10 种石斛 rbcL 基因的组成分析（略）3.2 遗传距离分析和聚类图的构建利用 Mega 4.1 软件进行遗传距离的计算分析，结果显示，10 种石斛属植物的 rbcL 基因序列的遗传距离范围为 0～0.925，翅梗石斛与细茎石斛之间遗传距离最大同时应用最大简约法（Maximum Parsimony）构建的严格一致树，其中简约法分析共获得 109 棵简约树，获得简约一致树的树长为 453 步，一致性指数（CI）为 0.995 5、存留指数（RI）为 0.995 4（见图 2） 由图 2可见，石斛组的大苞鞘石斛、细茎石斛、尖刀唇石斛、独角石斛和矩唇石斛关系较近；黑毛组翅梗石斛和距囊组的红花石斛关系也较近；瘦轴组的钩状石斛，石斛组的金钗石斛，顶叶组的密花石斛都单独为一类这与《中国植物志》对石斛的划分基本一致，在分子水平上显示了我国部分石斛属植物间的亲缘关系74 讨论将核酸序列数据用于探讨植物系统发育问题现已发展成为植物系统学中的一个重要分支领域，rbcL 基因是分子系统学研究中使用最为广泛的分子标记之一。

至今，已经测定了一千余种的种子植物rbcL 基因的序列，本文根据已测定的叶绿体 rbcL 基因序列，对 10种石斛的 rbcL 基因进行研究分析，为石斛属植物基于 rbcL 基因的系统发育研究打下基础石斛 rbcL 基因序列分析表明，石斛在进化过程中具有较高的遗传多样性；且 rbcL 基因在自然进化过程中变异性较低，适合用于分子系统发育树的构建基于 rbcL 基因序列构建的系统发生关系与经典的形态分类学结果基本一致，在分子水平上显示了我国部分石斛属植物间的亲缘关系在以后的研究中，可以增加样品的数量，也可通过多基因（matK、rbcS） 、多位点的研究来构建更详细的分子系统发育树，对石斛这一兰科植物的原始发生谱系做更深入的探讨在市场应用和生态保护方面，通过 rbcL 基因的序列比较，也为中药材的鉴定和野生石斛资源调查提供了分子水平的依据总之，传统的鉴定方法（形态学、细胞学）仍然不失为鉴定石斛的重要依据；但随着现代分子生物技术的发展，利用 PCR 技术扩增基因并测序，通过序列比对鉴定不同石斛的种类将在系统发育研究、分类研究、鉴定中发挥越来越重要的作用8【参考文献】［1］王康正，高文远，范垒. 石斛属药用植物研究进展［J］. 中草药，1997，28（10）：633.［2］张光浓，毕志敏，王峥涛，等. 石斛属植物的化学成分研究进展［J］. 中草药，2003，34（6）：5.［3］查学强，魏鹏，罗建平. 8 种产地铁皮石斛蛋白质和同工酶分析［J］. 安徽农业科学，2007，35（27 ）：8464. ［4］滕艳芬，吴晓俊，徐红. 石斛及其常见混淆品的 matK基因序列比较［J］. 中国药科大学学报，2002，33（40 ）：280.［5］徐红，李晓波，丁小余. 中药黄草石斛 rDNA ITS 序列分析［J］. 药学学报，2001，36（10）：777.［6］ 彭锐，宋洪元，李泉森，等. 石斛总 DNA 的提取及鉴定［J］. 中国中药杂志，2003，28（12）：1129。