《凋亡检测实验》PPT课件.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,凋亡检测,DNA LADDER,主 要 内 容,凋亡概述,凋亡检测方法的历史沿革,DNA Ladder,实验,实验原理,实验材料及试剂,实验步骤及结果,Apoptosis,Necrosis,Apoptosis(Kerr and Wyllie,1972),Apoptosis,A genetically programmed,non-necrotic,cell death.,Involved in tissue homeostasis,cell differentiation.,Play major role in a variety of diseases(e.g.Alzheimer,AIDS,heart failure and cancer).,凋亡与坏死的差别,凋亡 坏死,胞体 变小 变大,胞膜 皱缩,形成空泡 肿胀,通透性改变,结局 形成凋亡小体被邻近细胞吞噬细胞 崩解,引起炎症反应,胞核,涉及多个细胞,组织结,构被破坏,浓缩,DNA,断裂成180200,bp,或,其倍数的片段,与其他细,胞关系,不规则碎裂,溶解,通常只影响散在单个细胞,组织,结构不被破坏,Apoptotic Assay,Morphology,DNA Fragmentation,DNA Ladder,Caspase Activity,Anti-PARP western blot,Cell Membrane Alteration,Phosphotidylserine Exposure,Apoptotic Assay,Morphology,DNA Fragmentation,DNA Ladder,Caspase Activity,Anti-PARP Western blot,Cell Membrane Alteration,Phosphotidylserine Exposure,endonuclease,Gel electrophoresis,700,520,360,180,Base pairs,Distance between cuts=mutiple of 180 bps,180,bps,Apoptotic DNA Ladder,Lane 1:Marker,Lane 2:negative control,Lane 3:DNA of apoptotic cells,Lane 4:DNA of necrosis cells,金标准,实验原理,细胞凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活.,此酶可作用于连接,DNA,的核小体间区域,DNA,链被切割成180200,bp,或其整倍数的片断.,抽提,DNA,经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱,固定：,将细胞生前结构和化学物质双重地保存下来，需要先固定。

方法：,1,）物理固定，空气干燥，,冻结干燥2,）化学固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等实验步骤,获取凋亡细胞,抽提,DNA,琼脂糖凝胶电泳,实验步骤,取,16,g,大小的小白鼠,外科手术取胸腺,少许洗去血迹,放入研磨器中(160目)研磨,边磨边加1640液,获取单个胸腺细胞.将所得混悬液倒入三角烧杯,加入120,ml 1640,液(一般一只小白鼠可获2,x10,6,/ml,细胞),每孔加入1.2,ml DEX(5mg/ml),混匀,co,2,培养箱,37,0,c,5h,取1,ml,混悬液,加入24孔培养板中,将每孔细胞悬液转移至新的,Ep,管中,3000,rpm,5min,去上清,加入70%乙醇700,m,l,混匀.震荡打散细胞,-20,0,c,固定,过夜,离心，3000,rpm，5min,去上清（,不要回倒，棉棒沾干液体，勿触及沉淀,）,将上清转入,1.5ml EP,管，离心,12000rpm 3min,加400,ul,裂解液，加100,ul,蛋白酶,k,混匀，60,0,c,水浴，30-45,min,100ul,饱和,Nacl,充分震荡，离心,12000rpm 3min,将上清转入无水乙醇管，颠倒离心管数次可见白色絮状物（,DNA,）,离心1,2,000 rpm，1min，,弃上清，并用棉签吸干残留的无水乙醇,析出的,DNA,应成小白点状沉淀于管底，如贴附于管壁，加,溶解液时应小心。

取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析,加入,20ul,溶解液至管中，反复吸打数次至,DNA,溶解,电泳80,v,1h,吸出,20,ul,已溶解的凋亡细胞,DNA,，加入到,2%,琼脂糖凝胶孔电泳,1.取出胸腺后,一定要注意将组织去除干净2.样本须先经70%乙醇固定,以防止,DNA,降解3.70%乙醇,无水乙醇应-20,0,c,预冷4氯仿抽提蛋白时，应用振荡器剧烈振荡，吸移上清时，注意不要将蛋白质层吸动时（宁少勿多，以免蛋白质污染）,5可根据,DNA,量的多少加样6.用2%,agrose,电泳可获较佳分离效果注意事项,实验结果,。