HPLC—DAD测定人参首乌胶囊中8种人参皂苷类成分.doc

HPLC—DAD测定人参首乌胶囊中8种人参昔类成分摘要目的：建立同时测定人参首乌胶囊中8种人 参皂昔类成分含量的HPLC-DAD方法方法：采用Ultimate C18色谱柱(4. 6 nimX250 mni, 5 u m),流动相乙睛-水，梯 度洗脱，流速1 mL • min-1,柱温30 C,检测波长203 nmo 结果：人参皂Rgl, Re, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd, 20 (S) -Rg3 分别在 0. 242〜12.1, 0. 222-11. 1, 0. 251-25. 1, 0. 245—24. 5, 0. 232—23.2, 0. 232—23.2, 0. 264—26.4, 0. 244〜24.4 ug成良好的线性关系，平均回收率分别为 102.7%, 103. 2%, 101.6%, 101.2%, 102.0%, 100. 7%, 101.9%, 102. 0%o结论：该方法简便，准确，分离效果好，无干扰， 可用于人参首乌胶囊中上述8种成分的含量测定关键词人参首乌胶囊；人参皂昔；HPLC；含量测定收稿日期2013-03-08基金项目国家药品标准提高暨2015版药典科研项目； 国家“十二五”支撑计划项目(2011BAI03B01)通信作者*冯伟红，副研究员，主要研究方向为中药质 量分析,E-mail： weihong bj@126. com； *王智民，研究员， 研究方向为中药化学与质量控制，E-mail : zhmwl23@263. net作者简介吉丽娜，硕士研究生，E-胆订:jidoudou@163・ com人参首乌胶囊是由红参和制何首乌2味中药组成的复方制剂，具有益气养血的功效，临床上用于治 疗气血两虚所致的须发早白、健忘失眠、食欲不振、体疲乏 力等［1］。

2010年版《中国药典》一部人参首乌胶囊的含量 测定项下中仅以2, 3, 5, 4 -四務基二苯乙烯-2-0- 3 -D- 葡萄糖昔作为该制剂中制何首乌的质量评价指标，文献报道 中也曾有人采用荧光分光光度法［2］和RP-HPLC［3］对臣药制 何首乌中的蔥醍类成分进行测定红参作为该制剂处方组成 中的君药，又为贵重药材，在文献报道中也仅是测定了人参 皂昔Rgll个成分［4］,在药典标准中并未有相应的质量标准 对君药红参的质量进行控制，因而无法体现中医药整体作用 的特点本研究采用HPLC-DAD,建立了人参首乌胶囊中人参皂昔 Rgl, Re, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd, 20 (S) -Rg3 等 8 种成 分的同步含量测定方法，实现了对该制剂中红参的质量控 制结果表明该方法良好，可为2015年版《中国药典》中 人参首乌胶囊质量标准的修订提供参考1材料Shimadzu LC 20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT溶液 传输单元，SIL-20A自动进样器，SPD-M20A二极管阵列检测 器，CT0-10AS柱温箱，LC Solution色谱工作站(日本岛津 公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有 限公司），功率250 W,工作频率40 kHz； XS205型1/10万 天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）;Milli-Q A10纯 水机（美国密理博公司）。

人参皂昔Rgl （批号110703-201027）、人参皂昔Re （批 号 110754-200822）、人参皂昔 Rbl （批号 110704-200420）、 人参皂昔Rb2 （批号111715-200802）、人参皂昔Rb3 （批号 111686-201002）对照品均购自中国食品药品检定研究院， 规格为供含量测定用；人参皂昔Rc （批号R-008-120628）. 人参皂昔Rd （批号R-009-120826）和20 （S） -人参皂昔Rg3 （批号R-010-120506）对照品购自瑞芬思生物科技有限公 司，经面积归一化法测定，纯度均大于98%；乙睛、甲醇（HPLC 级，美国Fisher公司），超纯水由Mil 1 i-Q Al0纯水机制备人参首乌胶囊，郑州韩都药业集团有限公司，批号分别 为 110227, 120202, 1207312方法与结果2. 1 色谱条件 UltimateC18 色谱柱（4. 6 mm X 250 mm, 5 um）；流动相乙M（A）-水（B）,线性梯度洗脱，0〜20 min, 21%A, 20〜30 min, 21%〜23%A, 30〜35 min, 23%〜27%A, 35〜90 min, 27%〜2%A, 90〜100 min, 32%〜42%A, 100〜 110 min, 42%〜48%A,流速 1 mL - min-1；柱温 30 C；检 测波长203 nmo理论塔板数按人参皂昔Rbl的峰计算应不低于6 000o对照品、供试品和缺红参阴性供试品的HPLC图见图I-2.2对照品溶液的制备 取对照品人参皂昔Rgl, Re, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd 和 20 （S）-人参皂昔 Rg3 适量，精 密称定，加甲醇制成每ImL分别含上述成分0. 483, 0.444, 0.502, 0. 490, 0. 464, 0. 464, 0.529, 0. 488 mg 的混合对 照品溶液，备用。

2.3供试品溶液的制备 取人参首乌胶囊内容物粉末（过40目筛）约2.0g,精密称定，置索氏提取器中，加三 氯甲烷加热回流3 h,弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连 同滤纸筒移入100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL,称定 质量，超声提取30 min,取出，放至室温，再称定质量，用 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过取续滤液25 mL,减压 蒸干，用甲醇5 mL溶解并定容，摇匀，过0.22 Pm微孔滤 膜，取续滤液，即得 2. 4阴性供试品溶液的制备 按 照人参首乌胶囊处方比例和制备工艺制备缺红参的阴性样 品，按2. 2项下方法制备阴性供试品溶液2.5线性关系考察取上述混合对照品溶液，分别进样 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50 uL,测定各种人参皂昔的 峰面积以测得的峰面积和被测物的进样量（yg）,用最小 二乘法进行线性回归，得到各个成分的回归方程以及线性范 围，结果见表11. 人参皂昔Rgl; 2.人参皂昔Re； 3.人参皂＜ Rf；4.人参皂昔Rbl； 5.人参皂昔Rc； 6.人参皂昔Rb2；7.人 参皂昔Rb3； 8.人参皂昔Rd； 9. 20 (S)-人参皂Rg3o图1混合对照品(A)、人参首乌胶囊供试品(B)和缺 红参阴性供试品(C)的HPLC图Fig. 1 Chromatograms of referenee substances (A), Renshenshouwu capsule sample (B) and negative sample(C)表1人参皂昔类成分的线性方程和范围Table 1 Regression equations and ranges of eight ginsenosides2.6精密度试验取2.3项下的人参皂昔混合对照品溶 液，于同1日内连续进样6次，每次进样10 uL,测定人参 皂昔 Rgl, Re, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd 和 20 (S)-人参皂 昔 Rg3 的峰面积，其 RSD 分别为 0. 89%, 0. 90%, 0. 36%, 0. 24%, 0. 73%, 0. 22%, 0. 65%, 0. 87%,表明仪器的精密度良好。

2.7稳定性试验 取同批人参首乌胶囊(批号120731) 供试品溶液，分别于供试品溶液制备后第0, 3, 6, 9, 12, 15, 24 h 进样，测定人参皂昔 Rgl, Re, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd和20 (S)-人参皂昔Rg3的峰面积，其RSD分别为1. 9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.8%, 1.7%, 1.7%, 1.2%,表明供试品 溶液的稳定性良好2.8重复性试验 取同批人参首乌胶囊(批号120731)内容物，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液， 测定各成分峰面积，计算含量及其RSD测得Rgl, Re, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd和20 (S)-人参皂昔Rg3的质量分数分 别为 1. 56, 2. 80, 0. 480, 0. 750, 0. 780, 0. 510, 1. 81, 0. 610 mg - g-1；其 RSD 分别为 1.4%, 2.2%, 2.3%, 2.9%, 2.8%,2. 3%, 1.8%, 0. 70%,表明该方法的重复性良好2. 9加样回收率试验取同批人参首乌胶囊(批号120731)内容物约1.0 g,精密称定，分别按供试品含量- 对照品量大致1 ： 1的比例加入一定量的对照品溶液，按2. 2 项下方法平行制备6份供试品溶液，测定人参皂昔各成分的 峰面积，计算加样回收率及RSD,结果见表2。

表2人参首乌胶囊中8种人参皂昔类成分的加样回收率Table 2 Recoveries rate of eight ginsenosides续表22. 10样品的测定分别取不同批号的人参首乌胶囊3批，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液(n=2),精 密吸取10 PL注入高效液相色谱仪，测定人参皂昔的峰面 积，计算各成分的含量，结果见表3表3人参首乌胶囊中人参皂昔类成分的质量分数Table 3 The contents of eight ginsenosides inRenshenshouwu capsulesmg • g~l3讨论本试验中分别考察了不同提取溶媒(甲醇、乙醇、70% 甲醇、70%乙醇、水、正丁醇)、溶媒用量(30, 50, 70 niL). 提取方式(超声法、回流法、冷浸法)、提取时间(20, 30, 45 min)对人参皂昔含量的影响，结果表明以甲醇为提取溶 媒超声提取的效率最高，超声提取30 min各组分均可达到平衡调研发现，人参皂昔类成分在色谱分离中存在分离度 差、柱选择性强、重现性差等特点，长期以来一直是困扰广 大色谱工作者的一个棘手问题针对这些情况，在试验中曾 先后对 Ultimate C18, Hypersil GOLD C18, Spursil C18,Syncronis C18, Symmetry C18, Diamonsil C18 (2), Accursil C18, Welchrom C18, Luna C18等不同填料的色谱柱进行了 考察，结果发现，在本文确定的色谱条件下，Ultimate C18, Hypersil GOLD C18, Spursil C18等3种色谱柱对人参首乌 胶囊中8种人参皂昔类成分实现了基线分离且分离时间相对 较短，因此在进行人参类中药及其制剂的质量标准研究时， 建议使用上述3种填料色谱柱。

药监局批准的人参首乌胶囊生产企业有16个，但是目前市场上能收集到的仅 有郑州韩都药业集团有限公司一家产品，本研究的含量测定 结果表明，即使是同一生产企业的产品，人参皂昔的含量依 然存在较大差异由于人参首乌胶囊的制备工艺中红参是以 干粉直接压片入药，因此含量差异的来源主要是原料药(如产地及生长期等)及产品放置时间因此只有从源头上全面 控制红参药材及饮片的质量，制定切实可行的成品质量标准 才能保证该制剂的质量[参考文献][1] 中国药典.一部[s]・ 2010： 439.[2] 刘丹华，吴巧凤.荧光分光光度法测定何首乌及人 参首乌胶囊中总蔥醍的含量[J]・药物分析杂志，2007, 27(10)： 1636.[3。