生物化学与分子生物学实验技术课件.ppt

第三章：层析技术第三章：层析技术第三章第三章 层析技术层析技术 层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产， 还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器 层析技术的分类 (1) 按流动相的状态分类：用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相色谱；以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱 (2) 按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱) 、纸层析、薄层层析、薄膜层析等 (3) 按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等本章按第三种分类进行叙述 第一节 吸附层析 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法 吸附层析在各种层析技术中应用最早，由于吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生，装置简单 ，又具有一定的分辩率等优点，故至今仍广泛使用。

 凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体 固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的，而固体表面的分子所受的力是不对称的 向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外的一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的本节主要介绍吸附柱层析和聚酰胺薄膜层析 ，薄层吸附层析将在本章第六节介绍，气固吸附层析在第七节介绍一、吸附柱层析 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂  在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。

经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ，移动速度也不同吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层) 如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式 (一) 吸附剂的选择 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者在实践中不论选择那种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。

1.羟基磷灰石 2. 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，简称HA]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用 使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按1∶6体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用； (4) 就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。

而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好 用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能达到满意的流速 2. 硅胶 是最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力 水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析若将硅胶在105-110℃加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程称为活化如果将硅胶加热到500℃，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等 3.氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物 氧化铝用前也需脱水活化，通常于400℃高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间， 可得到Ⅰ级或Ⅱ级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。

4.大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离  (二) 洗脱涤的选择 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂合适的洗脱剂应符合下列条件： ①纯度较高； ②稳定性好； ③能较完全洗脱所分离的成分； ④黏度小； ⑤易和所需要的成分分开  洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐的缓冲液洗脱而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定 在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短 (三) 操作 柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统 1.层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管柱的直径与长度之比，一般为1∶10- 1∶40。

采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱反之，则宜用比例小的层析柱这样有利于节省时间和提高分辨率层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的 2.吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的当操作容量高时， 吸附剂用量少一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍 3.装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上装柱的方法分干装法和湿装法两种干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂此法不易将气泡排尽而湿装法系先加适量溶剂到柱内， 排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中， 待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生这种装柱法对各种基质都适用装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。

此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准 4. 上样和洗脱 经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2 (当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率)待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标，有合适的检测器和记录仪时，洗脱液流经检测器再收集，用记录仪可自动绘制洗脱曲线 理想的洗脱曲线如图3-1所示图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据 为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。

若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析) 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化 二、聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜(尼龙薄膜)层析是指样品溶液随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的不同，而将各组分分离的方法 聚酰胺是由己二酸与己二胺聚合而成或由己内酰胺聚合而成的高分子化合物含有大量酰胺基团，其羰基可与含羟基的物质形成氢键，其亚氨基又可与硝基化合物或醌类形成氢键，而产生吸附作用不同的物质由于形成氢键的能力不同，故吸附力也不同，通过吸附和洗脱就可达到分离目的  聚酰胺薄膜层析只适用于极性分子的分离如，酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸类物质等特别是在蛋白质的化学结构分析中，氨基酸衍生物，如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等的分析，灵敏度高，分辨力强，操作方便，速度较快 洗脱时，洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键，而使被吸附物解吸。

各种化合物与聚酰胺形成氢键的能力主要由物质的分子结构所决定此外也与所使用的溶液有关一般用水作溶剂时形成氢键的能力最强，故容易吸附，难于洗脱在有机溶剂中形成氢键的能力较弱，在碱性溶液中形成氢键的能力最弱，所以洗脱剂最好选用碱性溶液，如二甲基甲酰胺(DMF)溶液、稀氢氧化钠溶液或稀氨水等 第二节 分配层析 分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法 分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值： K=固定相中溶质的浓度/ /流动相中溶质的浓度 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响所以不同物质的分配系数不同而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数 在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的 次数越多，越容易被彻底分离。

 纸层析属于典型的分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用本节主要通过纸层析介绍分配层析的基本知识 此外，将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可构成薄层层析系统，由于薄层层析还可做吸附、离子交换等层析，将在本章第六节专门叙述，在硅藻土上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱上，以气体为流动相可构成气液分配层析，即气相色谱系统，在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱中，用一定的洗脱剂洗脱， 可构成液液分配层析，这种系统在高效液相色谱中应用普遍 气相色谱和高效液相色谱系统复杂，将在本章第七节和第八章专门介绍 二、纸层析 (一) 原理 滤纸一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，一般情况下较难脱去纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的  溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： Rf= a/ b式中a：溶质斑点中心的移动距离 b：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。

由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析 (二) 影响Rf值的主要因素 1.1.物质的结构和极性物质的结构和极性 2. 物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然 2.2.滤纸滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同 此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值，必要时要进行预处理，以去除杂质的影响例如：可用0.01-0.4mol/L的HCl处理滤纸，以除去滤纸上的金属离子，然后再用水洗至中性 层析滤纸由高纯度的棉花制成要求质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，并具有一定的纯度国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采用 3.3.层析所用的溶剂层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。

溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用处理的方法因溶剂的性质而异常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等举例如下： (1) 苯酚：重蒸馏，收集180℃的馏分 (2) 乙酸：在冰醋酸中加入1%重铬酸钾，蒸馏，收集118℃的馏分 (3) 正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氢氧化钠溶液洗涤，再用无水碳酸钾脱水， 用磨口蒸馏器蒸馏，收集117℃的馏分 4.pH4.pH值值 溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf值改变溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低 为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值，通过调节溶剂或样品溶液的pH值，使pH值保持恒定 5.5.温度温度 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积；同时在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例所以温度的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行 某些对温度敏感的溶剂系统，最好不要配成饱和溶液。

如水饱和的酚溶液，可改成酚∶水＝ 4∶1或5∶1等 6.6.展开方式展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较小 7.7.样品溶液中杂质样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值 (三) 操作方法 1.1.样品处理样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释 2.2.点样点样 将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用血球计数管或微量注射器)轻轻点在原点上样品点的直径约0.3-0.5cm点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量为5-30μg点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。

3.3.平衡平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，严重影响层析效果平衡一般在密闭的层析缸内进行 4.4.展开展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式 (1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动 上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长 (2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散  (3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。

滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱呈弧形用环行法展开时，最好使用无方向性的特制滤纸如东洋51UH滤纸等 （4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法” 5.5.显色显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示 (1) 显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法 (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点 6.6.定性分析定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性 7.7.定量分析定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。

(2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量 (3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量 第三节 凝胶层析 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域 一、基本原理 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的 样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度： Ka=(Ve-Vo)/ViKa=(Ve-Vo)/Vi 式中Ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积； Vo：外体积(outer volume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积； Vi：内体积(inner volume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。

当某组分的Ka=0Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出； 若某组分的Ka=1Ka=1(即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出； KaKa在0-10-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出 ，KaKa值大的后流出  上述内体积Vi可以从凝胶的干重和吸足水后的湿重求得，也可用小分子物质(如(NH4)2SO4,NaCl等)实际测量而得到(Vo+Vi) 外体积Vo可用相对分子质量很大的物质溶液(如血红蛋白、印度黑墨水、相对分子质量为200万的蓝色葡聚糖-2000、铁蛋白等)通过实际测量求出也可以从下式间接计算， Vo=Vt-Vi-VgVo=Vt-Vi-Vg 式中 Vg：凝胶基质本身的体积；Vi：内体积；Vt：层析柱内凝胶床的总体积 Vt可通过测量柱内径和凝胶床高度计算出来，即 Vt=Vt=（（1/41/4））πRπR2 2h h 洗脱体积Ve可通过加进某一组分后实际测量而得，也可以在已知Ka后计算出来即 Ve=Vo+KaVi Ve=Vo+KaVi  在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。

当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1然而在某种情况下Ka值会大于1这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程 对于同一类型的化合物而言，组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)的关系可用下式表示： Ve=KVe=K1 1- K- K2 2lgMrlgMr 式中K1，K2为常数  若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量在实际应用中多以相对洗脱体积Kav (Kav=Ve/Vt) 对lgMr作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验  二、凝胶的选择二、凝胶的选择 凝胶的种类很多，其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。

常用的有： (1) 聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺(CH3=CH-CONH2)与甲叉双丙烯酰胺(CH3=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2)共聚而成 商品名称为生物胶P(Bio-Ge1P)聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性的，适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化缺点是遇强酸时酰胺键会水解，一般在pH2-11的范围内使用  (2) 葡聚糖凝胶 由相对分子质量为4 ╳ 104-20 ╳ 104的葡聚糖交联聚合而成由Pharmacia (GE)公司生产的商品名为Sephadex的葡聚糖凝胶，具有良好的化学稳定性等优点，为最常用的凝胶之一Sephadex耐碱，在0.01mol/L盐酸中放置半年不受影响，故广泛用于各种物质的分离纯化 Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等多种型号、和粗、中、细、超细多种规格，G后面的数字越大，胶粒内的孔经越大，越适合于大分子的分离，但颗粒 的机械强度随孔经的增大而降低，较高的操作压会使G75、G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液的流速下降，故用上述型号的Sephadex进行层析时，流速慢，时间长。

同型号的Sephadex，颗粒越细，在同样柱长的柱子中分辨力越好，但流速也越慢  (3) 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶，可制成不带电荷的琼脂糖，用琼脂糖制成颗粒内孔径不等的多种型号层析用琼脂糖凝胶，商品为SepharoseSepharose的孔经大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子质量较大的分子 近年Pharmacia (GE)公司推出商品名为Supersose的琼脂糖凝胶，主要有含琼脂糖6%的Superose6 和含琼脂脂糖12%的Superose12 及其衍生物Superose刚性特好，理化稳定性高，在高黏度液体(如8mol/L尿素)下能保持较好的流速，适合于糖类、核酸、病毒和包含体蛋白在促溶剂中的纯化  4.聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 商品名Sephacryl，是由甲撑双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成的球形凝胶颗粒，反压特别低，机械性能好，分离速度快，分辨率高，理化稳定性好，在SDS、6mol/L盐酸胍及8mol/L尿素中均可使用有S-100HR、S-200HR、S-300HR、S-400HR、S- 500HR、S-1000SF6种型号，可分离相对分子质量1 ╳ 103-1 ╳ 108 的蛋白质，亦可用于分离多糖和核酸。

 5.Superdex5.Superdex Pharmarcia公司提供的新型凝胶过滤介质，是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成的球形凝胶珠，流速快、反压低、非特异性吸附很低，因而样品回收率很高，是目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质理化稳定性很高，在0.1mol/L HCl及0.1 mol/L NaOH中40℃保温400小时分辨力保持不变，在1% SDS、8mol/L尿素及6mol/L盐酸胍中均能保持良好的色谱性能，有多种型号可供选择，适合于生物大分子的精细纯化 三、操作三、操作 层析柱一般内径1-4cm，柱长10-150cm，装柱方法同吸附柱层析 加样方法同吸附柱层析，样品液浓度大些为好，但黏度不能过大，样品体积一般为柱体积的1%-10%凝胶柱平衡和洗脱一般用同一种溶液，洗脱液无特殊要求，一般选择使样品稳定的缓冲液洗脱液的流速要稳定，分离蛋白质和核酸时，常用输液泵、柱、检测器、分部收集器、记录仪构成层析系统，要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度， 记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速，若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度。

峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量 凝胶暂时不用时，可加少许防腐剂如0.02%叠氮钠或0.002%的洗必泰防止染菌用过的凝胶可加热灭菌后低温保存或用20%左右的乙醇保存  一、基本原理一、基本原理 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连 接，电荷基因与反离子以离子键结合 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA++B+ RB++A+ 第四节 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面 离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。

因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比所以，离子价数越高，结合力越大在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大 两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 pH与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强 离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力 氨基酸的离子交换分离原理氨基酸的离子交换分离原理氨基酸的分离过程氨基酸的分离过程二、离子交换剂二、离子交换剂 离子交换剂应满足的基本条件有： ①有高度的不溶性即在各种溶剂中不发生溶解； ②有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换； ③有较多的交换基团； ④ 有稳定的物理化学性质。

在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象 (一一) 离子交换剂的种类离子交换剂的种类 根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类： 1. 1. 疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不同的电荷基团离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团)和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性)  (1) (1) 阳离子交换剂阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电因此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型( 带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种 (2) (2) 阴离子交换剂阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺〔-N(CH3)3〕、叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔 -NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基团构成的。

当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂  树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体，其大小在20-50目之间近年Bio-Rad公司还制造了50-100目、100-200目以及200-400目的产品，目数大的树脂对提高分辨率和交换容量是有利的 疏水性的离子交换剂由于含有大量的活性基团，交换容量高、机械强度大、流动速度快因此，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质，其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、清洁剂(如tritonX-100)、尿素、两性电解质(Ampholyte)此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质 疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留能力阳离子交换树脂对氨基酸的分离 2.2.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 这类交换剂与水的亲和力较大，载体孔径大，适合于分离生物大分子，有多种类型： (1) 纤维素离子交换型 以纤维素为基质，常用的功能基因有磷酸基(P.中强酸型)、磺酸乙基(SE，强酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，强碱型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱碱型)、氨基乙基(AE，中等碱型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等碱型)等，可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型，Pharmacia (GE)公司生产的DEAE-Sephacel为球形颗粒，机械性能和理化稳定性好，对蛋白质、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交换容量，使用简单方便，在生物化学与分子生物学中使用普遍。

此外，Watman公司的DE-、CM-、P- 、AE-、SE-及QA-纤维素，Bio-Rad公司的CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些国产的DEAE-纤维素和CM-纤维素也可选择使用  (2) 葡聚糖系离子交换剂 以SephadexG25和G50为基质，分别引入DEAE、QAE(二乙基(二羧 丙基)氨基乙基，弱碱型)、CM、SP(磺丙基、强酸型)等功能基因，构成8种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除离子交换作用外，还有分子筛作用，但层析时床体积随洗脱剂离子强度的增加而缩小，以SephadexG50为基质的交换剂尤其明显，为使用带来不便  (3) 琼脂糖系列离子交换剂：琼脂糖系列离子交换剂： 以琼脂糖为基质，主要有Pharmacia (GE)公司的Sepharose和Bio-Rad公司的Bio-gel两个系列 ① Sepharose系列离子交换剂：早期产品为DEAE-Sepharose CL-6B和CM-Sepharose CL-6B ，对生物大分子分辨力好，交换容量大，床体积随洗脱液的离子强度和pH的改变小，使用较 Sephadex系列方便。

后续产品Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化稳定性和机械性能更好交换容量大，可以在床清洗，床体积随pH的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作引入的功能机团有Q(强碱性)、SP、DEAE、CM四种此外，Sepharose High Performnce (Sepharose HP)有Q-Sepharose HP和SP-Sepharose HP两种，颗粒细、分辨率高，理化稳定性好，流速和载量均适合于实验室或大量制备使用 ② Bio-GelA系离子交换剂：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA两种，回收率极高，床体积随pH和离子强度变化小，pH和化学稳定性好  (4) Source (4) Source系列离子交换剂系列离子交换剂 有Q(强碱型的)和S(强酸型)两种，是低压层析系统中分辨率最高，流速最快的离子交换剂，理化稳定性极好，可用1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用寿命长 ，样品回收率高，重复性好，工艺放大容易 (5) Mono Beads (5) Mono Beads系列离子交换剂系列离子交换剂 是Pharmacia (GE)公司推出的新型交换剂，以亲水性聚醚为基质 ，能快速分离蛋白质，肽和低聚核苷酸，动态载样量大，可分离从mg到g的单克隆抗体。

( (二二) ) 离子交换剂的选择离子交换剂的选择 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品因此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的一个重要环节 1. 1.阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂假设一蛋白质的等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂； 若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂 2. 2.强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择 一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂  3.3.反离子的选择反离子的选择 离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子所此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。

4.4.基质的选择基质的选择 树脂基质是疏水性化合物，而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物在分离生物大分子时，亲水性基质交换容量高，且对生物大分子物质的吸附和洗脱都比较温和，被分离物质活性不易受到破坏 要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析 综合考虑上述4个方面，选择的离子交换剂才能成功地分离样品 三、操作三、操作 1.1.离子交换剂的处理、再生和转型离子交换剂的处理、再生和转型 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后加大量的水悬浮除去细颗粒，尔后改用酸碱浸泡，以便除去杂质和使其带上需要的反离子疏水性离子交换剂可以用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液处理；而亲水性离子交换剂则只能用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理(室温下处理30分钟) 酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型在每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱  使用过的离子交换剂，可采用一定的方法使其恢复原来的性状，这一过程叫做再生。

再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以通过转型处理完成所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转为另一种反离子的过程比如，欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4Cl处理 长期使用过的树脂含有很多杂质，欲将其除掉，应先用沸水处理，然后用酸、碱处理用热的稀酸、稀碱处理效果更好树脂若含有脂溶性杂质时，可用乙醇或丙酮处理而长期使用过的亲水性离子交换剂的处理一般只用酸、碱浸泡即可原则上讲，去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结构和稳定性，不影响其原有交换容量的前提下进行  2.2.缓冲液的选择缓冲液的选择 离子交换剂不仅可以与被分离物进行交换，而且还可以与缓冲液中的离子进行交换因此，离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的pH值和离子浓度有密切关系 起始缓冲液pH值和离子强度要能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而杂质与交换剂不结合，则pH值一般比有效成分的pI高一个单位(用阴离子交换剂)或低一个单位(用阳离子交换剂)，离子强度为0.1时，就可很快地把有效成分与杂质分开或者选择起始缓冲液的离子强度和pH值，使有效成分与离子交换剂结合得不牢固，而杂质与离子交换剂结合得牢固，也能得到高纯度有效成分。

选用的洗脱液，其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值要按离子交换剂性质来选择  3.3.被分离物质的交换被分离物质的交换 使用离子交换剂的方法有两种：一种是柱层析法，也叫动态法，即将离子交换剂装入层析柱内，让溶液连续通过该法交换效率高，应用范围广；另一种是分批法，也叫静态法，即将离子交换剂置入盛溶液的容器内缓慢地搅拌该法交换率低，不能连续进行，但是，需要的设备简单，操作容易 柱层析法装柱的操作和要求与吸附柱层析相同离子交换剂的总用量要依据其交换容量和待吸附物质的总量(包括连续使用的全部量)来计算当溶液含有各种杂质时，必须考虑使交换量留有充分余地，实际交换量只能按理论交换量的25%-50%计算在样品纯度极低，或有效成分与杂质的性质相似时，则实际交换量应控制得更低些层析柱高与直径比例一般要大于10∶1，分离样品的成分复杂时，比例宜高一些，用于样品浓缩和脱盐时，比例可低一些  4.4.被分离物质的洗脱与收集被分离物质的洗脱与收集 在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。

梯度溶液按组成来分，一般有二种：一种是增加离子强度的梯度溶液是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；另一种是改变pH 值的梯度溶液该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，所用缓冲液的种类、pH值以及缓冲容量要认真选择，否则将达不到预期目的对于增加离子强度的梯度溶液，不管用于何种类型的离子交换剂，其离子强度绝大部分是增加的而改变pH值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减，实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定 梯度的形成可以借助梯度混合器K=VM/VR 洗脱液的离子强度和酸碱度的变化速率会影响层析的效果当被分离物之间的选择系数相差较小时，洗脱液的离子强度或酸碱度的变化速度小些，有利于分辨率的提高，但各组分的峰形过宽时，可通过适当增加梯度斜率来克服若各组分的选择系数差别大，有些组分不易洗脱时，洗脱液的离子强度或酸碱度变化率要大些 经洗脱流出来的溶液可用部分收集器分部收集，每管体积一般以柱体积的1-2%为宜。

降低分部收集体积，可提高分辨率分部收集的溶液经过检测分析，便可得知所含物质的数量以此为纵坐标，以相应的洗脱体积为横坐标，能绘制出洗脱曲线若被分离物可以用合适的检测器检测，则可使洗脱液流经检测器的比色池，用记录仪绘制洗脱曲线，如蛋白质和核酸可用紫外检测器分别检测A280或A260 第五节第五节 亲和层析亲和层析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化 亲和层析的示意图 一、配基与偶联凝胶的选择与处理一、配基与偶联凝胶的选择与处理 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。

当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联，或不易与配对分子载体结合为此通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(space arm) 偶联时，必须首先使载体活化即通过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的基团  活化载体(包括带连接臂的)已有商品出售Pharmacia公司出产的偶联凝胶(coupling gel)可以很简单地与所需的配基偶联，不需要特殊的设备和复杂的化学反应常用的有： (1) 溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B (CNBr-activated sepharose 4B)：通过自发反应可安全 、简便、快速地与含有伯胺基的配基偶联 (2) 氨基琼脂糖凝胶4B (AH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 长度的连接臂，可与含有羧基的配基偶联 (3) 羧基琼脂糖凝胶4B (CH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 长度的连接臂，可与含有氨基的配基偶联 (4) 活化的羧基琼脂糖凝胶 4B (Activated CH-sepharose 4B)：含有六碳连接臂和一个活化的酯化基团，可自发地与含有氨基的配基偶联。

(5) 环氧活化的琼脂糖凝胶 6B (Epoxy-activated sepharose 6B)：含有一条长的亲水连接臂，可与含有羟基、氨基或巯基的配基偶联 (6) 活化的巯基琼脂糖凝胶 4B (Activated Thiolsepharose 4B)：含有一分子谷胱甘肽作为连接臂，可与含有游离巯基的蛋白质配基可逆偶联 (7) 巯丙基琼糖凝胶 6B (Thiopropyl sepharose 6B)：含有一个较短的亲水连接臂 (2-巯 丙基)，可与含有巯基的蛋白质或其他小分子配基可逆偶联，也可以与重金属离子、烷基和芳香基反应，并且进一步与含有：C＝，—C=C—，—N=N—键的化合物反应  进行亲和层析之前，首先要根据目的物质的特性，选择与之配对的分子作为配基，然后根据配基的大小和所含基团等特性选择适宜的偶联凝胶，再在一定条件下使配基与偶联凝胶接合 例如：欲分离某一辅酶，必须选择与之配对的酶作为配基，由于酶 含有氨基，可选用活化的羧基琼脂糖凝胶4B (Activated CHSepharose 4B)作为偶联凝胶再按下述方法将配基与偶联凝胶连接起来： ①将Activated CH-Sepharose 4B在1mmol/L的冰冷HCl之中浸泡15min(每克干燥偶联凝胶用200mL HCL)，然后用玻璃滤器除去盐。

②将配基溶解于偶联缓冲液中(0.1mol/L、pH8.0的NaHCO3溶液中含有0.5mol/L NaCl) 将偶联凝胶与配基混合，先在室温下静置1h，再在4℃条件下维持4h，即连接完毕，除去偶联缓冲液 ③用高pH缓冲液(含有0.5mol/L NaCl的0.05mol/L、pH8的Tris缓冲液)和低pH缓冲液(含0.5m ol/L NaCl的0.05mol/L甲酸缓冲液，pH4.0)先后冲洗，即可使用也可泡在缓冲液中置于4-8℃冰箱中保存备用 二、亲和层析的操作条件二、亲和层析的操作条件 亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离子交换层析相似但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止生物大分子变性，常在低温(4℃)下进行亲和层析柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎中性的范围内上柱时流速应尽可能缓慢上柱后，用大量平衡缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物洗脱结束后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为止最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可重复使用暂时不用时，亲和层析柱应置于4℃低温保存 第六节 薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。

如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析 薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需15-30min，分辨力比纸层析高10-100倍，它既能分离0.01μg的微量样品，又能分离500mg基至更多的样品作制备用薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想 一、支持剂的选择与处理一、支持剂的选择与处理 薄层层析的支持剂种类很多(表3-1)使用时应根据欲分离物质的种类进行选择 支持剂颗粒大小要适当颗粒大，展开速度快但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm)，薄层厚度为1-2mm；无机类支持剂如氧化铝 、硅胶等的颗粒一般为150-300目，薄层厚度为0.25-1mm 在薄层层析中，使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析。

同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理  二、薄层板的制作二、薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、 干燥 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可以直立展开，而软板只能接近水平展开 薄层板常用的制作方法有：薄层板常用的制作方法有： 1.浸涂法：将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液在玻璃板上形成薄层 2.喷涂法：用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层 3.倾斜涂布法：将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成薄层 4.推铺法：在一根玻璃棒的两端适当距离处分别绕几圈胶布条，胶布条的圈数视所需薄层厚度而定，然后把准备好的支持剂倒在玻璃板上，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均衡地向一个方面推动，而制成薄层 推铺法既适用于干板的涂布和湿板制作其他方法只能用于湿板制作。

湿板制作中的一个重要环节是调浆，一般支持剂与蒸馏水或缓冲液之比一般为1∶2至1∶2.5 调浆时要调和均匀，但不宜用力过猛，以免产生气泡而影响分离效果 薄层板涂好后，让其自然干燥后方能使用若为吸附薄层层析，制好板后还需加热活化，目的是使其减少水分而具有一定有吸附能力  三、层析方法三、层析方法 1.1.点样点样 点样操作与纸上层析相似点样前，先将制好的薄层修整一下，然后在距一端2cm左右处划 一原线，并每隔2cm左右划一原点样品用合适的溶剂溶解，吸附薄层层析一般用氯仿、乙醇等有机溶剂溶解，不宜用水溶解点样可用微量注射器，或微量吸管、毛细管点样量一般在50μg 之内，点样体积不宜超过20μL样品液可直接点在薄层板的原点上也可点在圆形滤纸片上(直径2-3mm)，再把滤纸片小心地放在薄层板原点上，并加少许可溶性淀粉糊，使滤纸片粘牢在薄层板上 2.2.展开展开 展式方式与纸层析一样，有上行法、下行法等，但软板薄层只能近水平展开(与水平成10o-20o) 吸附薄层层析所用展开剂主要是低沸点的有机溶剂，一般采用2-3种组分的多元溶剂系统 展开剂的选择是根据被分离物极性、溶剂的极性以及支持剂的特性三方面来考虑。

分配薄层 层 析展开剂的选择与纸上层析相似离子交换薄层层析、凝胶过滤薄层层析展开剂的选择则与相应柱层析的洗脱剂的选择相同 3.3.显色显色 薄层层析展开后，如果样品本身有颜色，就可直接看到斑点所在位置若是无色物质 ，则需加以显色显色方法与纸层析一样，可用显色剂显色，也可用紫外光显色此外，如果薄层板是由无机物质制成的，还可以用强腐蚀性的显色剂，如硫酸、硝酸、铬酸或它们的混合物，这些强酸几乎可以使所有有机化合物变为碳，而成黑色斑点，但不能用于定量分析 4.4.定性与定量分析定性与定量分析 薄层层析法与纸层析一样，用Rf值来表示被分离物质在薄层上的位置，与已知标准物质 的Rf对照，可进行定性分析 定量分析时，可把斑点所在位置的支持剂连同物质一起刮下，然后用适当溶液将其从支持剂上溶解下来，再测定其含量用目测法比较样品斑点和对照品斑点的颜色深度和面积大小， 或测量斑点的面积，可以进行半定量分析和限度检查，有条件时，可用薄层扫描仪进行定量分析 第七节 气相色谱 一、基本原理一、基本原理 气相色谱法(gas chromatography，GC)是以气体作为流动相对混合组分进行分离分析的方法。

其中气固色谱的固定相是多孔性固体吸附剂，分离机理主要是基于吸附剂对组分的吸附能力不同；气液色谱的固定相是由担体表面涂渍固定液而组成，分离机理主要是基于固定液对组分的溶解度不同经色谱分离后的各组分随载气进入检测器，使其转变成电信号，并自动记录得一组峰形曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图  样品进入检测器前，在实验操作条件下，记录笔所走的路径，称为基线基线在短暂时间内的波动，称为噪声；基线在较长时间内的位移，称为漂移只有当噪声和漂移均很小的，仪器稳定性才好 进样开始至出空气峰所需的时间，称为死时间，以t0表示；进样开始至出某组分峰所需的时间，称为该组分的保留时间，以tR表示；扣除死时间后的保留时间，称为调整保留时间 tR′, tR′=tR- t0，第二组分的调整保留时间与第一组分的调整保留时间的比值， 称为相对保留值，以α21表示： αα2121=t=tR2R2/t/tR1R1 色谱峰的峰高，以h表示；峰高为一半处的色谱峰宽度，称为半峰宽，以W1/ 2表示；通过色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距，秒为基线宽度 ，以Wb表示 根据tR、tR′或α，可作定性；根据峰高h或峰面积A，可作定量测定，对称峰的面积可用下式计算：A=hA=h ×W ×W1/21/2 气相色谱法具有高效能、高选择性、高灵敏度、快速和应用范围广等优点，常用作有机物的分析。

 二、气相色谱的气路系统二、气相色谱的气路系统 气相色谱常用氮气作为载气，载送试样进入色谱柱；常用氢气作为燃气，氧气或空气作为助燃气 载气和燃气总是装在高压钢瓶内，使用时经减压、净化、调整流速后才进入色谱仪钢瓶外壳上有若干标记，如颜色、色环和气体压力常见的标记及含义见表3-2 使用时注意识别标记并检查压力等是否符合规定运输搬动时应戴上安全帽，不可在地上滚动钢瓶出口应首先连接减压表，经减压至0.2-0.4MPa或＜1MPa，再通入仪器的气路系统  在进行气相色谱分析时，应选择最佳色谱条件，其主要内容如下： 色谱柱：长度、内径、质料； 固定相：固体吸收剂；担体、固定液、液担比； 检测器：种类、使用温度； 流动相：载气名称、纯度、压力、流速等； 燃 气：名称、纯度、压力、流速等； 助燃气：名称、纯度、压力、流速等； 记录仪：类型、全程毫伏、纸速等  三、色谱柱 色谱柱是分离混合组分的关键部件色谱柱由柱管和固定相组成按照柱管的粗细与固定相的填充方法，色谱柱可分为两类： ①填充柱：由φ4-6mm，长2-4m的不锈钢管或玻璃管制成 ，其中填充吸附剂(气固色谱)或涂渍固定液的担体(气液色谱)。

②毛细管柱，常用φ 0.05 - 0.5mm，长几十至几百米的金属、玻璃或塑料管，将固定液直接涂在毛细管的内壁上制成 (一) 担体 在填充柱中所用的担体，要求表面积大，颗料均匀；表面呈化学惰性，不与被分离物质反应 ；热稳定性好，有一定的机械强度担体可分为两大类： 1.硅藻土型担体：由天然硅藻土经煅烧而成，因含少量氧化铁而呈粉红色，故称为红色担体，如201型、6201型、C 22保温砖、Chromsorb P等；如果在煅烧前加少量碳酸钠作助溶剂，煅烧后使氧化铁生成无色的铁硅酸钠，则称为白色担体，如101型、102型、Celite 545、Chromosorb(AGW)、Gas Chrom (APQSZ)等 硅藻土型担体表面常含有＞Al-O-、Fe-O-和 Si-OH(硅醇基)，使担体表面具有活性，造成固定液分布不均匀，使色谱峰拖尾为此需要进行酸洗(AW)、碱洗(BW)或硅烷化处理常用的硅烷化试剂为二甲基二氯硅烷(DMCS)，可除去硅醇基的影响 2.非硅藻土类担体：如聚四氟乙烯担体、Teflon-6、玻璃球担体、高分子多孔微球GDX等，GDX由苯乙烯与二乙烯苯聚合而成。

(二二) 固定液固定液 有数百种之多，按照化学分类法可分为： 1. 1.烃类：烃类：包括烷烃和芳烃，常用的沙鱼烷(异三十烷、C30H62)是标准的非极性固定液 2. 2.硅氧烷类：硅氧烷类：是目前应用最广的通用型固定液，化学结构如105页所示，其优点是温度黏度系数小，蒸气压低，流失少，对多数有机物的溶解能力强，包括从弱极性到极性的多种固定液，按化学结构又可分为： (1) (1) 甲基硅氧烷：甲基硅氧烷：R为甲基，n＜400者为甲基硅油，n＞400者为甲基硅橡胶，是一类应用很多的耐高温弱极性固定液 (2) (2) 苯基硅氧烷：苯基硅氧烷：R为苯基，n＜400为甲基苯基硅油，n＞400为甲基苯基硅橡胶根据苯基与甲基的比例不同分为：低苯基硅氧烷(如SE-52, 5%, 300℃)；中苯基硅氧烷(如OV17，50%, 350℃)；高苯基硅氧烷(如OV-25，75%，300℃)极性随苯基含量的增高而增强 (3) (3) 氟烷基硅氧烷：氟烷基硅氧烷：R为三氟丙基(-CH2CH2CF3)，是一类中等极性固定液，强碱作用下易解聚，只能与酸性载体配伍。

(4) (4) 氰基硅氧烷：氰基硅氧烷：R为氰乙基(-CH2CH2CN)，是一类强极性固定液，氰乙基含量越高，极性越强  3. 3.醇类：醇类：氢键型固定液，分聚合醇与非聚合醇两类，样品中形成氢键能力强的组分保留时间长，其中聚乙二醇(PEG)根据相对分子质量不同分为PEG-400、PEG-600和PEG-20M(20M表示相对分子质量为2万)较常用 4. 4.酯类：酯类：是中强极性固定液，分为非聚合酯与聚酯两类，聚酯类多是二元酸及二元醇生成的线性聚合物，如丁二酸二乙二醇聚酯(PDEGS或DEGS)，使用时要注意，酸、碱或200℃以上 水蒸汽能使聚酯水解  四、检测器四、检测器 检测器的作用是将由色谱柱分离出来的各组分转变成电信号常用的检测器有以下三种 1. 1.火焰离子化检测器火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID) (flame ionization detector,FID) 由色谱柱流出的有机组分，在氢火焰中燃烧裂解为CH自由基，CH自由基与O2反应生成CHO+及e-，CHO+又与火焰中的水蒸气分子碰撞产生H3O+，在300V电压的电场中，带电离子和电子被对应的电极吸引作定向运动而产生电流。

电流的大小与被测有机组分的含量成正比 2. 2.电子捕获检测器电子捕获检测器(electron capture detector,ECD)(electron capture detector,ECD) 含强电负性元素(O、N、Cl、S等)的化合物，能捕获电子，常用ECD来检测含量其原理是：当纯载气(如氮气)进入检测器时，受β射线照射，电离生成阳离子和电子阳离子向阴极移动，电子向阳极移动，形成约10-8A的电流含强电负性元素的化合物进入检测器时，捕获电子而成为阴离子，与载气电离生成的阳离子碰撞形成中性分子由于这一过程使电极间的阳离子和电子数目减少，从而使电离电流降低，故记录器上出现倒峰电离电流降低的数值与载气中这种组分的含量成正比 3.3.火焰光度检测器火焰光度检测器(flame photometric detector,FPD)(flame photometric detector,FPD) 含硫磷的有机物在FPD的富氢焰(H2∶O2＞3∶1)中燃烧时，含硫物首先生成激发态的S*分子；当它回到基态时，发射出波长为394nm的光含磷物氧化燃烧为磷的氧化物，被富氢焰中的氢还原成HPO碎片，能发射出526nm的光，通过滤光片分光后，由光电倍增管接收，信号经放大，由记录器记录色谱峰。

五、气相色谱的定性和定量方法五、气相色谱的定性和定量方法 1.1.定性定性 常利用保留时间tR、调整保留时间tR′及相对保留值α21定性可用已知纯品作对照或在样品中加纯品后看峰高的增加对于未知范围的混合物，单纯用气相色谱定性则很困难，可与红外分光光度计或质谱仪联用来鉴定特定的组分 2.2.定量定量 准确测定流出曲线的色谱峰面积是定量分析的基础，峰面积可以用峰高乘半峰宽或峰高乘平均峰宽法计算，但近年出厂的气相色谱仪均具数据处理机或色谱工作站，能自动显示和打印峰面积和峰高，在已知峰面积的情况下，常用的定量方法有： (1) (1) 外标法：外标法：即以待测组分的纯品为对照物，测定样品的含量，通常将对照物配成系列浓度，分别测定峰面积，确定工作曲线，在完全相同的条件下，测出样品中待测成分的峰面积，用标准曲线计算其浓度若组分的线性关系好，标准品可只用两个浓度确定工作曲线，称外标二点法，若工作曲线线性关系好，且过零点时，标准品可只用一个浓度，用比例式计算待 测成分的含量，称外标一点法计算式为： W=A﹒Ws/AsW=A﹒Ws/As 式中W与A分别代表样品中组分的重量和峰面积，Ws和As代表标准品进样体积的纯品重量和峰面积。

外标法较简便，缺点是标准品和样品的进样量和实验条件很难完全重复  (2) (2) 内标法：内标法：在样品中加入样品中不含有，且与待测成分保留时间相近，又能完全分开的纯品物质作内标物，根据内标物的重量和峰面积，用待测成分的峰面积来计算其重量，这种方法称内标法，优点是定量结果与进样量的重复性无关，缺点是内标物不易找寻且制样麻烦 (3) (3) 叠加法：叠加法：用不加标准品和加一定量标准品的样品，在加样量和层析条件完全相同的条件下做两次层析，根据内标物的加入量和峰面积的增加量可算出待测组分的含量，操作和计算较简单，缺点是两次层析的加样量和层析条件很难完全重复  (4) (4) 归一化法：归一化法：计算待测成分峰面积占流出曲线中各组分峰面积总和的比例，可算出待测成分在样品中的相对含量，称归一化法，优点是操作简便，定量结果与进样量的重复性无关，缺点是某些不产生检测信号的组分会造成计算结果的误差，另外，相同含量的不同组分，往往产生不同的峰面积，故每一组分相应的峰面积都应乘以定量校正因子，前述内标法计算时也要乘以定量校正因子不少物质的定量校正因子能从气相色谱手册上查到，查不到者可通过与手册提供的基准物质的比较测出。

气相色谱的定量计算不很简单，近年出厂的仪器配有色谱工作站可完成定量计算 第八节 高效液相色谱 一、概述一、概述 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)，又称高压液相色谱法 、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛 二、二、HPLC的特点的特点 HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号， 由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点 1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa 2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢 3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。

4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析 由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；当沸点较高(＞450 ℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析 三、三、HPLC的分类的分类 HPLC可以分为很多类别，按分离机制可分五种主要类型 1.1.液固吸附色谱液固吸附色谱 以吸附剂为固定相，以不同极性的溶剂为流动相，根据试样中各组分吸附能力的不同而进行分离的方法，称液相吸附色谱在HPLC中常用全多孔型硅胶微粒为吸附剂，直径5-10μm，由于颗粒小且多孔，故柱效很高 2.2.液液-液分配色谱液分配色谱 流动相与固定相均为液体的色谱法，称液-液分配色谱法或简称液- 液色谱法，按照固定相和流动相极性的差别，可分为正相与反相色谱法两类 (1) (1) 正相液液色谱法正相液液色谱法 流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。

洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相中溶解度大，后流出色谱柱 原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以烷烃等为流动相，由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代化学键合相是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相正相色谱常用的氰基键合相，性质与硅胶类似，只是保留时间略小氨基键合相的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类的分析 正相色谱以有机溶剂为流动相，使用成本较高  (2) (2) 反相液反相液- -液色谱法液色谱法 流动相极性大于固定相的液-液色谱法称反相液-液色谱法，洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱为了防止固定液的流失，反相色谱法均使用化学键合相，典型的反相化学键合相，用多孔性载体上化学键合的十八烷基(octadecysilyl,缩写ODS 或C18)为固定相，流动相常用甲醇-水或乙腈-水非典型反相色谱系统，由弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相构成 反相键合色谱法固定相不流失，流动相以水为主，用甲醇或乙腈调节极性，应用范围很宽，且使用成本低，在HPLC中应用最广 一般的反相色谱法，主要用于分离分析非极性和中等极性的化合物，但用两种改进的方法， 亦可分离离子化合物。

其一为离子对色谱法，在流动相中加入样品离子的反离子，使其与样品离子构成不荷电的中性离子对，增加其在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，改善分离效果分析碱类时可在流动相中加入烷基磺酸盐(PIC)，分析酸类则加入四丁基季胺盐(PIC-A)如四丁基胺磷酸盐(TBA)等这种方法可以使C18柱子一柱多用，用其取代离子交换法，可避免离子交换法流动相对泵和流路的腐蚀，缺点是PIC等试剂较贵其二为离子抑制色谱法，通过调节流动相的pH，抑制样品组分的解离，增加其在固定相中的溶解度在流动相中加入醋酸等弱酸，氨水等弱碱，磷酸盐及醋酸盐等缓冲盐调节pH即可用于分离有机酸和有机碱这种方法比离子对法成本低，但重复性差，且要注意，流动相的pH应在 2-8之间，超出此范围可能使键合基团脱落，实验后要及时用不含缓冲盐的流动相冲洗，以防腐蚀仪器流路系统  3.3.离子交换色谱离子交换色谱 由于聚苯乙烯树脂类具膨胀性，不耐压，HPLC的离子交换剂多用薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面化学键合各种离子交换基团，常用的为强酸性磺酸基和强碱型季铵盐其中全多孔硅胶为基体的离子交换剂柱效高，载样量大，有较好的耐压性和理化稳定性，但在pH＞9的流动相中硅胶易溶解，未键合的残留硅醇基易生成硅酸盐，故只能在pH0-8使用，层析过程中要控制流动相的pH的离子强度。

4.4.空间排斥空间排斥( (凝胶凝胶) )色谱色谱 葡聚糖等软质凝胶在压强0.1MPa左右即被压坏，不宜在HPLC使用由苯乙烯和二乙烯苯交联而成的半硬质凝胶柱效较高，常用有机溶剂为流动相，缺点是具膨胀性，流动相流经时柱的填充状态会发生变化以多孔硅胶及多孔玻璃珠等无机材料制成的硬质凝胶，在溶剂中不变形，但装柱时易碎，柱效较差，吸附性较强，有时易拖尾 5.5.亲和色谱亲和色谱 常用的基质有高度交联的Sephadex和Bio-gel等琼脂糖凝胶，大孔径聚丙烯酰胺凝胶和多孔硅胶，配基选择及交换剂合成的原理类似经典亲和层析，目前已有许多商品化的亲和色谱固定相和色谱柱可供选择 此外，还有手性固定相HPLC，在生物化学中使用不多，故不再介绍  四、四、HPLC的仪器构成的仪器构成 高效液相色谱仪通常由溶剂输送系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统四部分组成 1. 1.高压泵：高压泵：由于HPLC的固定相颗粒很小，柱阻力很大，故载液必须用高压泵来输送，通常柱前压达15-30MPa，才能获得高速的液流，以达到快速分离目的载液要预先脱气，流路中不应产生气泡，并要避免尘粒，以免堵塞泵和柱子，故使用前载液常在减压下通过0.45μm的滤膜进行过滤和脱气。

有时还用梯度洗脱装置，使载液的组成(浓度、离子强度、极性和pH值)随时间而连续改变，以提高色谱分离的效果 2. 2.进样装置：进样装置：为了将试样有效地送入色谱柱，可用微量注射器通过六通进样阀的进样口注入样液；亦可将样液先注入与柱头相连的贮样环管，然后利用切换阀让载液将样品定量地送入色谱柱  3. 3.色谱柱：色谱柱：HPLC所用的色谱柱大多为内径2mm、长度0.3m左右的直形短柱固定相可通过干法或湿法在高压下装入色谱柱，要求填充均匀多数使用者可直接购置各种类型的预装柱，在使用过程中由于杂质污染往往使柱效逐渐降低，因此，每次测定后要用流动相慢速 (0.1mL/min)冲洗柱子，使其再生加预柱也是保护色谱柱延长使用寿命的好办法 4. 4.检测器：检测器：目前应用较多的是紫外检测器、差示折光检测器和荧光检测器紫外检测器是基于试样中的待测组分对特定波长的紫外光有选择性的吸收，其吸光度与组分消光度成正比的关系进行检测的为了适应HPLC的要求，测量池的体积都很小，一般为5-10μL，光路长5-10mm差示折光检测器是利用连续测定流通池中溶液折射率的变化来测定试液浓度的检测器。

由于溶有待测组分的流动相与参比流动相之间折射率的差值，与待测组分在流动相中的浓度成正比，故可根据折射率的改变来测定待测组分的含量荧光检测器是根据某些物质在紫外光照射下具有荧光的特性来检测的，具有很高的灵敏度，适用于检测有π-π共轭体系的大分子及结构复杂的化合物，如蛋白质、氨基酸、维生素、稠环芳烃等有些无π-π共轭体系的分子通过柱前衍生法引入荧光基团亦可用荧光检测器检测  五、定性定量方法五、定性定量方法 HPLC定性、定量的原理与气相色谱法相同，有纯物质标准品时，可用纯物质的保留时间或调整保留时间与样品中相应组分的对比来定性无纯物质标准品时，通常用HPLC-MS(质谱)联 用仪或HPLC-FTIR(干涉分光型红外分光光度计)联用等方式定性，但仪器间的接口技术比气相色谱与光谱仪器联用复杂 定量方法与气相色谱法基本相同但由于很难查到相同实验条件下的定量校正因子，故使用校正归一化法较少由于HPLC进样量较大，而且可以用六通阀定量进样，进样量误差较小，故常用外标法定量，一般要用外标工作曲线法检验线性范围及工作曲线是否通过原点，只有截距为零时，才能用外标一点法定量为了减小实验条件波动对分析结果的影响，一般每次测定都同时进对照品与样品溶液，称随行外标一点法，定量计算的方法与气相色谱法相同。

HPLC的内标法与气相色谱相同，且使用较少，故不详述 第四章 电泳技术  带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，简称EP )1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金 50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药、某些工业 分析中必不可少的手段 第一节第一节 基本原理基本原理 一、泳动度一、泳动度 带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示： U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/VtU=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt 式中，U(也可以用m表示)为泳动度(cm2/V穝)；v为颗粒泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；l为支持物的有效长度(cm)；V为实际电压(V)；t为通电时间(s或min)。

电泳后通过侧量V,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度 泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F=EQF=EQ 式中，E为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q为被分离物所带净电荷 根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F′为： F′=6πrηvF′=6πrηv 式中，η为介质粘度，r为分子半径，v为分子移动速度 当平衡时：F=F′，即 EQ=6πrηvEQ=6πrηv ∴ v=EQ/6πrη ∵ U=v/E ∴ U=Q/6πrη ∴ v=EQ/6πrη ∵ U=v/E ∴ U=Q/6πrη 由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关 二、影响泳动度的因素二、影响泳动度的因素1.1.电场强度电场强度 电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。

电场强度越高，则带电颗粒泳动 越快根据电场强度的不同，电泳可分为： (1)常压(100-500V)电泳其电场强度为2-10V/cm分离时间较长，从数小时到数十小时 ，适合于分离蛋白质等大分子物质 (2)高压(2000-10000V)电泳其电场强度为50-200V/cm，电泳时间很短，有时只需几分钟 多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质2.2.溶液溶液pHpH 为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程 度，亦即决定其所带电荷的多少对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则颗粒 所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢因此分离某种蛋白质混合液时，应选择一个合适的pH使欲分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异3.3.溶液的离子强度溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间溶液离子强度(ionic strength)的计算公式如下： I=1/2ΣczI=1/2Σcz2 2 式中，I为离子强度，c为离子的摩尔浓度(mol/L),z为离子价数，价数越高，则离子强度越大。

 如：求0.015mol/L Na2SO4的离子强度 Na2SO4 2Na++SO42- I=1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.0454.4.电渗电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷， 与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好 5.5.温度温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样 品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置6.6.支持物支持物 现代的电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳电泳结束后，支持物可以很方便地进行染色等后续处理，因此，使用很广泛对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫 外吸收常用的支持物有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等 近年兴起的毛细管电泳可不用支持物，并可与检测装置连接使用。

此外，借助两性电解质的等电聚焦，电泳与免疫技术结合的免疫电泳，也是电泳的常用技术 第二节 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成将之溶于丙酮等有机溶剂中， 即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约以0.1-0.15mm为宜太厚吸水性差，分离效果不 好；太薄则膜片缺少应有的机械强度而易碎目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂 家生产的薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致  醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点： (1)分离效果好对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性 (2)快速省时由于亲水性较滤纸小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所 以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右 (3)灵敏度高，样品用量少血清蛋白电泳仅需2μL血清，故常用于检测在病理情况下微量 异常蛋白的改变 (4)应用面广某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋 白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。

 (5)易保存，易定量醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡 后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存 由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子 第三节 琼脂糖凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果  目前多用琼脂糖为电泳支持物 进行平板电泳，其优点如下： (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。

 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定制成干膜可长期保存 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶将琼脂糖电泳与免疫化学相结合 ，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验 方法之一 二、二、DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的 浓度也有密切关系1.1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 (1)DNA (1)DNA分子的大小：分子的大小：在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通 过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开此时电泳的迁移率 不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。

 (2) (2)琼脂糖的浓度：琼脂糖的浓度：如表4-1所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离 2. 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalently closed circular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶 中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以 长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝 胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响 3. 电泳方法电泳方法 (1)(1)凝胶类型凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)水平型电泳时，凝胶板完 全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式目前更多用的是后者，因为它制胶和加样 比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因 而受到人们的欢迎 (2)(2)缓冲液系统缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。

 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 ，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8)，配制方法见附录电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液 ，临用时稀释到所需倍数 TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用TBE浓溶液长期贮存会出现沉 淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5 ×工作也可提供足够的缓冲能力 (3)(3)凝胶的制备凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直 胶膜，插入梳子，自然冷却 (4)(4)样品配制与加样样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料， 含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使样品集中为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5% Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油 (5)(5)电泳电泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。

在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃，进行电泳 (6)(6)染色和拍照染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析 三、印迹转移电泳三、印迹转移电泳 生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不 适合于进行杂交操作，1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法，具体操作方法见实验5-8随后， Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹，1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。

1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上 ，称Eastern印迹 目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器的使用方法可参照厂家说明书聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维素膜更方便 进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，pH要远离pI，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或电流不可过高  四、交变脉冲电场凝胶电泳四、交变脉冲电场凝胶电泳 一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动 方向伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。

1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为零的滞留时间)与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改变方向，从而使DNA按分子大小分开后来，Carle等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通过电泳分开电泳系统是由一个水平式电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组负极为W，正极为E  一块正方形琼脂糖凝胶板(10cm×10cm或20cm×20cm)呈45o 置于中央，电场在N-S和W-E之间交替建立电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中首先向S极移动，然后改向E极在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进(图4-1)DNA分子净移动方向与加样线(图中点线)垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带交变脉冲电泳可有效分离数百万bp的大分子DNA。

较新式的仪器电极间的 角度和脉冲时间均可调，使用更加方便 此外，琼脂糖平板常用于免疫扩散技术，和电泳技术相结合的多种免疫电泳由于涉及免疫学技术，本章不作介绍 第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳一、聚丙烯酰胺凝胶的特点 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)  聚丙烯酰胺凝胶有下列优点： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好 (2)化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应 (3)对pH和温度变化较稳定 (4)几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好 (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节 (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

 PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备， 还可测定相对分子质量、等电点等 二、凝胶聚合的原理及有关特性二、凝胶聚合的原理及有关特性 1.聚合反应 凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂TEMED的碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活Acr单体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成网状凝胶碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5%的凝胶在pH8.8时30min聚合，在pH4.3时约需90min 此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多 2. 凝胶孔径的可调性及其有关性质凝胶孔径的可调性及其有关性质 (1) (1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚 合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比 T(AcrT(Acr和和BisBis总浓度总浓度)%=[(a+b)/m] )%=[(a+b)/m] ××100100 c( c(交联剂百分比交联剂百分比)%=[b/(a+b)] )%=[b/(a+b)] ××100100 其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)。

 a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关当a/b＜10时，凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色 ；a/b＞100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易于断裂欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应 控制a/b=30左右不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%,B is＜0.5%，凝胶就不能聚合当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度通常，T为2%-5%时 ，a/b=20左右；T为5%-10%时，a/b=40左右；T为15%-20%时，a/b=125-200左右，为此Richard等(1965)提出一个选择c和T的经验公式； c=6.5−0.3T 此公式适用于T为5-20%范围内的c值，其值可有1%的变化在研究大分子核酸时，常用T= 2.4 %的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖在T=3%时，也可加入20%蔗糖以增加机械性能，此时，并不影响凝胶孔径的大小 (2)凝胶浓度与孔径的关系：T与c不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关系极为密切一般讲，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大此外，孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。

 (3)凝胶浓度与被分离物相对分子量质的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的相对分子质量也不同，其大致范围如表4-2 在操作时，可根据被分离物相对分子质量大小选择所需凝胶的浓度范围也可先选用7.5%凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果如分 析未知样品时也可用4%-10%的梯度胶测试，根据分离情况选择适宜的浓度以取得理想的分离效果 3. 影响凝胶聚合的因素影响凝胶聚合的因素 (1)Acr (1)Acr及及BisBis的纯度：的纯度：应选用分析纯的Acr及Bis，两者均为白色结晶物质，λ280无吸收如试剂不纯，含有杂质或丙烯酸时，则凝胶聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合， 因而需进一步纯化 Acr及Bis固体应避光，贮存在棕色瓶中，因自然光、超声波及γ射线均可引起Acr自身聚合 或形成亚胺桥而交联，造成试剂失效Acr和Bis贮液的pH值为4.9-5.2，当pH值的改变大于 0.4pH单位则不能使用，因在偏酸或偏碱的环境中，它们可不断水解放出丙烯酸和NH4+ 而引起pH值改变，从而影响凝胶聚合。

因此，配制的Acr和Bis贮液应置棕色瓶中，4℃贮存 ，存放期一般不超过1-2个月为宜  (2)AP (2)AP、核黄素、、核黄素、TEMEDTEMED：：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP为白色粉末，核黄素 为黄色粉末，应在干燥、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4℃冰箱贮存，一般AP溶液仅能存放一周TEMED为淡黄色油状液，原液应密闭贮于4℃冰箱中增加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成 (3)pH (3)pH：：碱性条件下聚合较快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合 (4) (4)温度：温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5℃)聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般25-35℃聚合较好 (5) (5)氧分子：氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂 三、三、PAGE原理原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷 效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。

 不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶 样品胶的T=3%,c=2%，其中含有一定量的样品及pH6.7的Tris-HCl缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释目前，一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果 分离胶的T=7.0%-7.5%,c=2.5%，缓冲液为pH8.9的 Tris-HCl，大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷此胶主要起分子筛作用 1.样品浓缩效应 (1)凝胶孔径的不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶在 电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在三层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简称Tris) 及HCl。

Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子HCl在任何pH溶液中均易解离出(Cl-)，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子在电极缓冲液中，除有Tris 外，还有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2 CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子血清中大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带 (3)电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带 2.2.分子筛效应分子筛效应 大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 ，这就是分子筛效应。

 蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出3.3.电荷效应电荷效应 在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率净电荷多，则迁移快； 反之，则慢因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳 目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性  进行PAGE时，一般将胶灌在两块玻璃板之间，制成垂直板，垂直板电泳的优越性有： (1)表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰 (2)在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定， 还可用于印迹转移电泳及放射自显影 (3)胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。

 (4)胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描 (5)可进行双向电泳 四、四、SDS-PAGE原理原理 SDS即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与SDS总浓度、离子强度及温度有关，为了使单体和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物，需要采取低离子强度，使单体浓度有所升高在单体浓度为0.5m mol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1m mol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4g SDS/g蛋白质；在低于0.5m mol/L浓度时，其结合比一般为0.4gSDS/g蛋白质由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。

不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同 ，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比  目前，用SDS-PAGE研究过的蛋白质已有数百种，均证实此法测定蛋白质Mr的可靠性现在，市场有标准蛋白试剂出售测定未知蛋白质Mr时，可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度，同时进行SDS-PAGE，则可根据已知Mr蛋白质的电泳迁移率和Mr的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得Mr本方法有仪器设备简单，操作方便，样品用量少 ，耗时少(仅需一天)，分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展它不仅用于蛋白质Mr测定，还可用于蛋白混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究  然而SDS-PAGE也有不足之处，尤其是电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如 糖蛋白)及一些结构蛋白等测出的Mr不太可靠如组蛋白F1，本身带有大量正电荷，虽然结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷，故用SDS-PAGE测得的Mr为35 000， 而用其他方法测定的Mr仅为21 000。

因此要确定某种蛋白质的Mr时，最好用2种测定方法互相验证尤其是对一些由亚基或两种以上肽链组成的蛋白质，由于SDS及巯基乙醇的作用 ，肽链间的二硫键被打开，解离成亚基或单个肽链，因此测定结果只是亚基或单条肽链的Mr ，还需用其他方法测定分子中肽链的数目  尽管连续SDS-PAGE在测定蛋白质Mr方面已取得令人满意的结果，然而其浓缩效应差近年来 ，趋向用不连续SDS-PAGE，其分辨率较连续SDS-PAGE高出1.5-2倍如腺病毒2型蛋白质用 连续SDS-PAGE分离出5种蛋白质条带；而用不连续SDS-PAGE则分离出10种蛋白质条带这主 要是因为不连续SDS-PAGE有较好的浓缩效应其基本原理与分析血清蛋白所用的不连续PAGE相同，只是在操作上有区别： (1)不连续SDS-PAGE在凝胶、电极缓冲液中均加进了SDS，蛋 白质样品溶解液含有1%SDS和1%巯基乙醇，样品液加样前经过37℃保温3h或100℃加热3min； (2)不连续SDS-PAGE分离胶浓度为13%，而不是7%，因为在此不连续系统中，凝胶浓度低于10%时，Mr低于25 000的蛋白质走得快，且常和溴酚蓝染料走在一起，甚至超过染料，而13% 浓缩胶则有较好的效果。

五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳原理五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳原理 蛋白质是两性电解质，当pH＞pI时带负电荷，在电场中向正极移动；当pH＜pI时带正电荷，在电场中向负极移动；当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI利用pI不同，以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier amphol ytes)，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移 至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE,简释IEF-PAGE) 1. 两性电解质载体两性电解质载体 两性电解质载体是用多烯多胺和不饱和酸合成的脂肪族多氨基多羧基化合物的混合物，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的pI目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异而有不同的商品名称，如Ampholine(LKB公司)、Servalyte(Serva公司) 、Pharmalyte(Pharmacia公司)。

一般溶液浓度为40%或20%，其pH范围分别为：2.5-5，4-6.5，5-8，6.5-9，8-10.5，3-10等用IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI时可先选用pI3-10的两性电解质载体及同一范围的标准pI蛋白，将其与未知样品同时电泳，固定染色后，以pH值为纵轴，距阴极迁移距离(cm)为横轴作出pH梯度标准曲线(图4-2)， 根据染色后未知蛋白质迁移距离可推知其pI为进一步精确测定未知物的pI，还可选择较窄范围的两性电解质进行电泳，以提高分辨率如实验时，无标准pI蛋白质作标定依据，则电泳后立即用表面微电极每隔0.5cm直接测定胶板的pH值，制作pH梯度曲线，染色后根据迁移距离推知某种蛋白质的pI  两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂，它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦 因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1%-2%国内生产的两性电解质载体色黄，导电性略差，但只要控制凝胶中终浓度不超过2%，电泳时电压不要太高，仍可用于分析等电聚焦为提高分辨率可适当延长电泳时间 pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的pI有关。

2. 电极溶液电极溶液 应选择在电极上不产生易挥发物的液体作为电极缓冲液，阴、阳电极溶液的作用是避免样品及两性电解质载体在阴极还原或在阳极氧化，其pH值应比形成pH梯度的阴极略高，比阳极略低值得指出的是不同厂家合成两性电解质的方法不同，应根据说明书选用有关电极溶液 表4-4为Pharmacia公司生产的Pharmalyte pH梯度范围与有关电极液 3. 丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合 在采用AP催化化学聚合时，为防止氧分子存在影响聚合，在加AP前应对溶液脱气此催化系统在碱性条件下容易聚合，在酸性条件下(pH＜5)凝胶聚合比较困难，这可能是在酸性条件下，AP不能充分发生氧原子，使单体成为游离基，因而阻碍凝胶聚合，可在凝胶中加入1% 的AgNO3促使凝胶聚合凝胶聚合后，为防止酶的钝化，在加样前进行15-30min预电泳， 然后将样品放在其pI附近 在pH3-10、中性及碱性pH条件下，加入TEMED可加速凝胶聚合，但在pH＜5时无加速作用 TEMED为碱性物质，在pH4.5以上能扩展PAG碱性端pH梯度，其扩增幅度与TEMED加入量有关 郭尧君等人实验表明：在20mL凝胶溶液中，加入50μL TEMED，在距阴极0.3mm处可扩展0.7pH;加入100μL TEMED在阴极处能扩展1.3pH，也就是说pH3.5-9.5的两性电解质载体可 扩展到pH3.5-11的梯度范围。

因此加入TEMED对碱性蛋白质的分析极为有利，可用于分离细胞色素C、溶菌酶、组蛋白等 4. 样品预处理及加样方法样品预处理及加样方法 实验证实盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲例如，将L-氨基酸氧化酶分别溶于不同浓 度的NaCl,Tris-HCl及磷酸钠缓冲溶液中，从IEF-PAGE染色图谱可看出高浓度及低浓度Tris -HCl缓冲液对pH梯度形成影响较小，而NaCl及磷酸钠缓冲液干扰pH梯度形成并使区带扭曲 为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾但某些蛋白质在等电点附近或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，则可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶 极矩作用增加蛋白质的溶解性；也可将样品溶解在含有2%两性电解质载体的溶液中，因它含有可反应的氨基，并能除去氰酸盐，此时样品最好加在经预聚焦的凝胶板的阳极侧，因在pH 5以下，既没有氰酸盐也没有氨基甲酰化存在此外，还可在样品及凝胶溶液中加入非离子 去污剂如Tween80, TritonX-100,NonideP40等或加入相同浓度的尿素(4mol/L)，为防止氰酸 盐引起蛋白质的氨甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。

 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度如用考马斯亮蓝R250染色，加样量可为50-150μg；如用银染色，加样量可减少到1μg一般样品浓度以0.5-3mg/mL为宜，最适加样体积为10-30μL如样品很浓，可直接在凝胶表面加2-5μL； 如样品很稀，可加样300μL将其放在一特制的塑料小框中或用一小块泡沫塑料及高质量的滤纸或擦镜纸吸取样品放在凝胶表面由于IEF-PAGE是按蛋白质pI分离，电泳后各种蛋白质被浓缩并停留在其pI处因此样品可加在凝胶表面任何位置，既可将样品放在中间，也可放在整个凝胶板中电泳后均可得到同样的结果值得指出的是，对不稳定的样品可先将凝胶进行15-30min预电泳，使pH梯度形成，然后将样品放在靠近pI的位置以缩短电泳的时间，但不要将样品正好加在pI处和紧靠阳、阴极的胶面上，以免引起蛋白质变性造成条带扭曲一般加样电泳半小时后，取出加样滤纸以免引起拖尾现象 5. 功率、时间、温度等因素功率、时间、温度等因素 功率是电流和电压的乘积在IEF电泳中，样品的迁移越接近pI时，电流越小为使各组分能更好地分离，就应不断增加电压，缩短pH梯度形成和蛋白质分离所需的时间。

但过高的电压会使凝胶板局部范围由于高阻抗而过热烧坏，为此，在电泳过程中，应通冷却水，水温以4-10℃为宜，流量5-10L/min避免使用过低的温度，以免冷凝水滴形成超薄板(0,5mm)TFE分辨率高就是因为易冷却  IEF-PAGE时间与功率取决于多种因素，如聚丙烯酰胺的质量、AP和TEMED用量、胶板厚薄、两性电解质载体的导电性和pH范围窄pH范围电泳时间比宽pH范围时间长，这是因为在窄pH范围蛋白质迁移接近pI，带电荷少，故迁移慢为了提高分辨率，就要增加电压，缩短电泳时间，防止生物活性丧失 IFE-PAGE操作简单，只要有一般电泳设备就可进行，电泳时间短，分辨率高，应用范围广，可用于分离蛋白质及测定pI，也可用于临床诊断，农业、食品研究，动物分类等各种领域 随着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又进而发展到超薄型水平板等，还可与其他技术如SDS-PAGE结合，进一步提高灵敏度与分辨率 六、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳原理六、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳原理 双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。

如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大1975年，O’Farrell等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF-PAGE，第二向为SDS- PAGE的双向分离技术，简称为IEF/SDS-PAGE；基本原理与IEF-PAGE，SDS-PAGE完全相同  一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF-PAGE，取出胶条用于第二向电泳第一向电泳的方法同IEF-P AGE，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素第二向电泳时，先将SDS-PAG灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间，待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3μL 1%溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制)密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时，停止电泳第二向电泳时， 用梯度混合器将凝胶制成7.5%-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率  目前，已有5，000余种蛋白质分采用IEF/SDS-PAGE得到很好的分离，其高分辨率是各种类型单向PAGE及其他双向PAGE所无法比拟的。

因此，IEF/SDS-PAGE双向电泳已成为当前分子生物学领域内常用的实验技术，可广泛用于生物大分子如蛋白质，核酸酶解片段及核糖体蛋白质的分离和精细分析，是蛋白质组学的基本方法随着该技术的不断改进与发展，其应用范围将更加广泛 然而，此技术对某些碱性蛋白质的分离却有其局限性，因在第一向IEF-PAGE的电泳体系中，含有高浓度的尿素，它的存在会使碱性区的pH梯度变得很窄而且不稳定，可使碱性蛋白质难以进入凝胶中或者易泳出凝胶外因此，对碱性蛋白质的分离分析应采用其他方法 选出特定的斑点，可用于质谱法测序用质谱法测序：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸Edman化学降解法: 用此原理已制成蛋白质序列分析仪若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.540.9960=0.54蛋白质组学研究的其它基本方法 根据核苷酸序列推定法：分离mRNA，经反转录测定cDNA的核苷酸序列, 再用遗传密码推定氨基酸序列。

欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息； 美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验 美国政府支持的Gen Bank和欧洲的 EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息研究蛋白质构象的方法研究蛋白质构象的方法X射线衍射法 基本规律：X射线穿过原子平面层时，当光程差等于波长的倍数，反射波可以互相叠加形成衍射斑点如图5-2所示，光程差等于2dsinθ,上述规律可总结为Bragg方程： 2dsinθ=nλ(n=±1, ±2, ±3…)核磁共振(NMR) 在外加磁场的作用下，原子核的自旋方向达到一致，可以和一定频率的外加磁场共振而形成吸收峰，同一种原子核在分子中的位置不同，因其外围的电子云对核的屏蔽作用引起的吸收峰位置移动（化学位移）也不同，由吸收峰的位置可以推断原子处于哪一个基团，在1H NMR谱中，当相邻基团上有n个质子时，该基团的质子吸收峰将分裂成n+1个峰ccbbaa氨基酸的氨基酸的1H NMR谱谱蛋白质结构的预测二级结构的预测 参照表5-6,按Pi=Ai(被计算的氨基酸残基处于某一二级结构的份数）/Ti (肽链中的各种氨基酸残基处于某一二级结构的份数）的计算值预测, Pi大于1表示该氨基酸残基倾向于形成所预测的二级结构，Pi小于1表示该氨基酸残基倾向于形成其他构象。

三级结构的预测和计算机模拟 七、染色方法七、染色方法 经醋酸纤维薄膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支持 物相应位置上显示出谱带，从而检测其纯度、含量及生物活性蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、 核酸及酶等均有不同的染色方法 (一一) )蛋白质染色蛋白质染色 染色液种类繁多，各种染色液染色原理不同，灵敏度各异使用时可根据需要加以选择常 用的染色液有：1.1.氨基黑氨基黑10B(amino black 10B)10B(amino black 10B) 氨基黑10B的λmax=620-630nm，是酸性染料其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料之一，但对SDS-蛋白质染色效果不好另外，氨基黑10B染不同蛋白 质时，着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等)，定量时误差较大，需要对各种蛋白质作出 本身的蛋白质-染料量(吸收值)的标准曲线，更有利于定量测定 2.2.考马斯亮蓝考马斯亮蓝R R250250(coomassie brilliant blue R(coomassie brilliant blue R250250，简称，简称CBB RCBB R250250 ) ) 考马斯亮蓝R250的λmax=560-590nm。

染色灵敏度比氨基黑高5倍该染料是 通过范氏作用与蛋白质结合，适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超过一定 范围时，染色不合科Beer定律，作定量分析时要注意这点3.3.考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250( (简称简称CBB GCBB G250250) ) 蓝马斯亮蓝G250的λmax=590-610nm染色灵敏度不如R250，但比氨基 黑高3倍其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色， 所以常用于需要重复性和稳定性的染色，适于用定量分析 这两种CBB染色法也有缺点，由于CBB用乙酸脱色时容易从蛋白质上洗脱下来，且不同蛋白质 洗脱程度不同，因而影响光吸收扫描定量的结果如染色时间不够时，浓带的两边着色较深 而易造成人为的双带在用CBB染色时，均用酸与醇固定蛋白质，但一些碱性蛋白质(如核糖 核酸酶与鱼精蛋白)及低相对分子质量的蛋白质、组蛋白、激素等不能用酸或醇固定，相反 它们还会从凝胶中洗脱下来为解决这一问题，可将电泳后的凝胶放在含0.11% CBB R250的25%乙醇及6%甲醛溶液中浸泡1h，甲醛在氨基酸的氨基与PAGE的氨基之间形成亚甲基 桥，从而把肽与凝胶连接在一起。

对于含SDS的凝胶，可在含3.5%甲醛的染色液中染色3 h，脱色则需要在3.5%的甲醇及25%乙醇的溶液中过夜4.4.固绿固绿(Fast green FG)(Fast green FG) 固绿的λmax=625nm，酸性染料染色灵敏度不如CBB，近似于氨基黑，但却可克服CB B在脱色时易溶解出来的缺点5.荧光染料 (1)丹磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰氯dansyl chloride，简称DNS-Cl)：在碱性条件下与 氨 基酸、肽、蛋白质的末端氨基反应，使它们获得荧光性质，在波长320nm或280nm的紫 外灯下，观察染色后的区带或斑点蛋白质或肽经丹磺酰化后并不影响电泳迁移率，而且，丹磺酰化蛋白质，分离后从凝胶上洗脱下来仍可进行肽的分析 ，不受蛋白酶干扰在 SDS存在下，也可用本法染色，将蛋白质溶解在含10%SDS的0.1mol/L Tris-HCl乙酸盐缓冲液(pH8.2)中，加入丙酮溶解的10%丹磺酰氯溶液，并用石蜡密封试管，50℃水浴保温15min ，再加入β-巯基乙醇，使过量的丹磺酰氯溶解，这种混合物不经纯化就可电泳 (2)荧光胺(fluorescamine又称fluram)：其作用与丹磺酰氯相似。

由于自身及分解产物均不 显示荧光，因此染色后没有荧光背景只是由于引进了负电荷，会引起电泳迁移率的 改变，但在SDS存在下这种电荷效应可忽略近来，荧光胺常用于双向电泳的蛋白染色  (3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮(MDPF)：其作用与荧光胺类似，也是与末端氨基产生 反应而产生荧光 (4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthal-sulfonic acid简称ANS)：常用其镁盐，本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下可见黄绿色荧光6.银染色法此法较CBB R250灵敏100倍，染色机制 可能与摄影过程中Ag+的还原相似具体方法见实验4-4 (二二)糖蛋白染色糖蛋白染色1.过碘酸-Schiff试剂 将凝胶放在2.5g过碘酸钠，86mL H2O,10mL冰乙酸，2.5mL浓HCl,lg三氯乙酸的混合液中， 轻轻振荡过夜接着用10mL冰乙酸，lg三氯乙酸，90mL H2O的混合液漂洗8h，其目的是使 蛋白质固定再用Schiff试剂染色16h，最后用1g KHSO4，20mL浓HCl，980mLH2O的混合 液漂洗2次，共2h操作在4℃进行，结果可在543nm处作微量光密度扫描，也可接着用氨基黑复染。

2.阿尔山蓝(alcian blue)染色 凝胶在12.5%三氯乙酸中固定30min,用蒸馏水漂洗放入1%过碘酸溶液(用3%乙酸配制)中氧 化50min，用蒸馏水洗涤数次去除多余的过碘酸盐，再放入0.5%偏重亚硫酸钾中30min，还原剩余的过碘酸盐，再用蒸馏水洗涤最后浸泡在0.5%阿尔山蓝(用3%乙酸配制)染4h (三三)脂蛋白染色脂蛋白染色1.油红O(oil red)染色 将凝胶先置于平皿中，用5%乙酸固定20min,用H2O漂洗吹干后，再用油红O应用液染色18h ，在乙醇∶水=5∶3中浸洗5min，最后用蒸馏水洗去底色必要时可用氨基黑复染2.苏丹黑B(sudan black B) 将2g苏丹黑B加60mL吡啶和40mL醋酸酐、混合，放置过液再加3000mL蒸馏水，乙酰苏丹黑 即析出抽滤后再溶于丙酮中，将丙酮蒸发，得粉状乙酰苏丹黑将溶于 无水乙醇中，使呈饱和溶液用前过滤按样品总体积1/10量加入乙酰苏丹黑饱和液将脂蛋 白预染后进行电泳 (四四)核酸的染色核酸的染色 将凝胶先用三氯乙酸、甲酸-乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸镧等固定，或者将有关染料与上述溶液配在一起，同时固定与染色。

有的染色液可同时染DNA及RNA，如stains-all、 溴乙锭荧光染料等，也有RNA，DNA各自特殊的染色法1.RNA1.RNA染色法染色法 (1) (1)焦宁焦宁Y(pyronine Y):Y(pyronine Y):其对RNA染色效果好，灵敏度高脱色后凝胶本底颜色浅而RNA 色带稳定，抗光且不易褪色此染料最适浓度为0.5%低于0.5%则RNA色带较浅；高于0.5% 也并不能增加对RNA染色效果 (2) (2)甲苯胺蓝甲苯胺蓝O(toluidine blue O)O(toluidine blue O)：：其最适浓度为0.7%，染色效果较焦宁Y稍差些 (3) (3)次甲基蓝次甲基蓝(methylene blue)(methylene blue)：：染色效果不如焦宁Y和甲苯胺蓝O，检出灵敏度较差，一般 在5μg以上；染色后RNA条带宽，且不稳定，时间长，易褪色但次甲基蓝易得到，溶解性 能好，所以较常用 (4) (4)吖啶橙吖啶橙(acridine orange)(acridine orange)：：染色效果不太理想，本底颜色深，不易脱掉，但能区别单链或双链核酸(DN A，RNA)，对双链核酸显绿色荧光(530nm)，对单链核酸显红色荧光(640nm)。

 (5)荧光染料溴乙锭(ethidium bromide简称EB)：可用于观察琼脂糖电泳中的RNA、DNA带EB能插入核酸分子中碱基对之间，使DNA和RNA在紫外灯下显示较强的荧光如将已染色的凝胶浸泡在1m mol/L MgSO４溶液中1h，可以降低未结合的EB引起的背景荧光，对检测极少量的DNA有利EB染料具有下列优点：操作简单，凝胶可用1-0.5μg/mL的EB染色，染色时间取决于凝胶浓度，低于1%琼脂糖的凝胶、染15min即可多余的EB不干扰在紫外灯下检测荧光；染色后不会使核酸断裂，因此可将染料直接加到核酸样品中，以便随时用紫外灯追踪检查；灵敏度高，对1ng RNA，DNA均可显色EB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套 2.DNA染色法 除了EB染色最常用外，还有以下几种方法 (1)甲基绿(methyl green)：一般将0.25%甲基绿溶于0.2mol/L pH4.1的乙酯缓冲液中，用氯仿抽提至无紫色，将含DNA的凝胶浸入，室温下染色1h即可显色，此法适用于检测天然DNA  (2)Feulgen染色：用此法染色前，应将凝胶用1mol/L HCl固定，然后用Schiff试剂在室温下染色，这是组织化学中鉴定DNA的方法。

第五节 高效毛细管电泳 一、基本原理 高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱在熔融石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基(Si-O-)阴离子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双电层 层外缘扩散层中富集的阳离子被电场阴极吸引导致溶液向阴极的流动，这种效应称为电渗(electroosmosis)电渗流的速度ueo和电场强度E成正比，定义电渗速度ueo和场强E的比值为电渗淌度μeo，即 μμeoeo=u=ueoeo/E/E  电渗淌度和硅氧层表面的电荷密度成正比，和离子强度的平方根成反比在低pH条件下，硅氧层形成分子(Si-OH)，因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减小如在pH9的绷砂缓冲液中电渗速度约2mm/s，而在pH3介质中电渗速度减小约1个数量级影响电渗的一个重要因素是毛细管中因电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于边缘的温度，形成抛物线型的温度梯度，管壁附近温度低，中心温度高，结果使电渗速度不均匀而造成区带变宽，柱效降低。

为此，应避免使用过长和内径大于50μm的毛细管柱，还应注意减小毛细管的壁厚、选择适宜的电压和缓冲液及使用良好的冷却系统  HPCE中观察到的离子淌度是离子的电泳淌度(μep)和溶液的电渗淌度的加和定义表观淌度为μapp，则 μμappapp=μ=μepep+μ+μeoeo 根据以上的讨论，带正电荷的离子的μep＞0,μ eo＞0,故μapp总是为正号，离子向阴极移动；而带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，μep＜0，在高pH条件下，若 μeo＞μep, μapp仍为正号，离子仍然可向阴极移动，但在低pH条件下，μapp可为负号，离子将向反方向移动此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析的离子  对于实际速度为unet(net指net speed)的组分，表观淌度可由下式计算： μμappapp=u=unetnet/E=(L/E=(Ld d/ t/ t））/ /（（V/LV/Lt t) ) 式中Ld是从进样口到检测器的实际柱长，Lt是总柱长，V是电压，t是所需的分析时间 实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时 μep=0,μeo=μapp，μep=μeo，上式为： μμeoeo=u=u中性中性/E= (L/E= (Ld d/t/t））/ /（（V/LV/Lt t) ) HPCE的毛细管容易冷却，故可以使用20-30KV的高电压，由于管内径只有25-100μm，无涡流扩散，使传质阻抗趋于零，因此，有很高的分辨率。

电解质液由毛细管阳极端进入毛细管，携带被分离的组分可以从毛细管阴极端流入检测器的比色池，电泳过程与结果分析均容易自动化因此HPCE已成为效率极高的现代分析仪器，在生物化学和分子生物学中得到日益广泛的应用  二、实验方法二、实验方法1.1.仪器结构特点仪器结构特点 HPCE的分辨力和高压电源的电压成正比其电压一般都高达20-30kV高压源是仪器的重要部件，要求有良好的电压稳定性和较高的输出电压 但过高的电压会在毛细管内部产生焦耳热，因此电压升高应适宜，还要使用冷却剂或其他冷 却方式降低毛细管的温度 制备毛细管的材料最常用的是熔融石英，这是由于熔融石英传热效果好，并可直接用紫外或荧光方式检测为了防止折断，通常在毛细管外壁涂一层高分子材料，增强其柔韧性， 其内壁可用稀碱和缓冲液冲洗，并用压入法或抽出法完成 电解质贮液槽一般用玻璃或塑料瓶及细铂丝电极制成，内充一定pH值的缓冲溶液；充满溶液的毛细管两端分别放入两个槽内，当高压电源和铂丝连接输出电压后形成闭合电流回路 为了能够控制毛细管内部的环境，除了改变缓冲液的pH值外，还可加入十六烷基三甲基溴化铵等表面活性剂改变电渗流的方向。

应用硅烷化、高聚物涂渍等技术修饰毛细管内壁，以便减少吸附，改善峰形，也是常用的技术2.2.进样方法进样方法 进样方法对HPCE的分离效率和再现性有重要影响HPLC中使用的微量注射器进样、进样阀进样已不再适用，较多使用的方法是压差进样和电动进样两种 压差进样，又称动力进样(hydrodynamic injection)是利用毛细管虹吸原理进样，只要将毛细管插入缓冲液，准确计时，样品进入毛细管的体积V为 V=(△PπdV=(△Pπd4 4t t））/ /（（128ηL128ηLt t) ) 式中△P是毛细管两端的压力差，d是毛细管的内径，η是样品液的粘度，Lt是毛细管的 总长，t是进样时间 电动进样(electrokinemic injection)利用电渗机制使样品在外加的进样电压作用下沿毛细管内壁进入毛细管一定时间t进样的量用下式计算 n n样样=μ=μappapp[E[E（（k kb b/k/ks s)]tπr)]tπr2 2C C式中n样是进入毛细管的样品量(mol),μapp是表现淌度，E是电场强度，kb和ks是缓冲液和样品液电导的比值，r是毛细管的半径，C是样品浓度(mol/m3 )电动进样对黏度较大的样品更为适用。

但定量重现性较差，且可能发生因各组分扩散系数的 区别形成迁移速度的不同，形成所谓的样品失真 3.检测方法检测方法 检测方法可分为直接检测和间接检测两类直接检测法所用的检测器和高效液相色谱法相类似，有紫外、荧光、电化学等但是为了提高灵敏度，可采用聚光增强入射光强度、提高光程长度等措施 对无法直接检测的样品需间接检测常用方法是在电泳缓冲液中加入具有检测响应的添加剂，如发色团、荧光物质等，作为产生基线信号的本底响应进样后样品离子和添加剂离子分别产生正峰和负峰，使基线信号发生改变而予以检测 三、分离类型及应用三、分离类型及应用1. 1. 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 毛细管区带电泳法(capillary zone electrophoresis,CZE)的分离基于组分淌度的区别，一般毛细管内壁带负电荷 电渗流从阳极移动至阴极，流出顺序是阴离子＜中性分子＜阳离子若毛细管内壁涂上一层阳离子表面吸附剂，则极性颠倒，流出顺序是阳离子＜中性分子＜阴离子 毛细管区带电泳具有分离方便、快速、样品用量小的特点，在无机离子、有机物、氨基酸、蛋白质及各种生物样品的测试中有着广泛的应用。

2. 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 CZE主要用于分析带电荷的离子，对中性分子的测试主要是依靠电渗的作用，分离比较困难此时可应用胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)进行分离分析 MECC是在缓冲溶液中加入表面活性剂，当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，则形成荷电胶束而当无胶束存在时，所有中性分子将同时到达检测器，有胶束时带负电荷的胶束在电场作用下向相反方向泳动，溶质分子在胶束和水相间形成平衡，在溶液的电渗流和胶束的电泳流的共同作用下分离溶质分子在胶束内停留时间越长，其迁移所需时间即保留时间越长  最常用的表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)各种阴阳离子表面活性剂和环糊精等添加剂使得本法有相当多的选择余地，可广泛用于各种类型的样品，在手性分离中也有成功的应用 3. 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)是在毛细管中填充具线状缠结聚合物结构的物理凝胶，使样品中各组分通过净电荷差异和分子大小差异双重机制得以分离。

CGE在蛋白质、多肽、DNA序列分析中得到成功应用，已成为生命科学基础和应用研究中有力的分析工具 近年来，其它类型的毛细管电色谱法(capillary electro-chromatography,CEC)发展很快其中填充毛细管电色谱法(packed colomn CEC)是将细粒径固定相填充在毛细管柱中，开管毛细管电色谱法(open tubolar CEC)是把固定相的官能团键合在毛细管内壁表面而形成的色谱柱CEC是很有前途的分析方法 使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳道一次可测大约1000个核苷酸测序已成为可以快速完成的常规技术，人类基因组测序已经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点基因组多态性研究和功能基因组学研究任重道远第五章 分子生物学基本技术  九十年代分子生物学的知识体系发生了明显变化，细胞生物学和经典遗传学的内容和研究技术一般不再纳入分子生物学生物分子含量测定，生物大分子的沉淀、离心、层析、电泳等技术，属于生物化学的基本技术，本书前四章已做了较详细的介绍本章介绍的分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等。

第一节第一节 DNADNA的体外合成的体外合成 一、DNA的化学合成 DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设 计制造的1.合成的原理 核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物  固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMTr保护，3′-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和-OCH3两个基团每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1) 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5′-OH 。

2) 缩合：新生成的5′-OH 在四唑催化下与下一个核苷3′-磷酰亚胺单体缩合使链增长3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸2.2.合成后处理合成后处理 合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用(1) (1) 切割：切割： 合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH(2) (2) 脱保护：脱保护： 切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱掉(3) (3) 纯化：纯化： 纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。

纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化近年来发展了一些修饰试剂，可以在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新的途径 二、聚合酶链式反应技术二、聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术PCR 技术由Mullis及其同事于1985年在Cetus公司发明并命名，不过Khorana及其同事在1971和1974年对该技术的详细原理即有描述，只是由于当时并没有发现热稳定性DNA聚合酶使其应用受到限制PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术Mullis因其卓越的贡献而与Michael(寡核苷酸基因定点诱变发明者)分享1993年的诺贝尔化学奖 (一一)PCR的基本原理的基本原理 双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以 增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。

(二二)典型典型PCR的反应体系的反应体系1.1.耐热耐热DNADNA聚合酶：聚合酶： 耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶 ，Sac DNA聚合酶其中Taq聚合酶应用最广泛Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95℃Taq酶的最适温度是72 ℃，较高温度下的DNA合成错误率较低因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR 走向自动化 纯化的Taq DNA聚合酶有5′→3′外切酶活性，而无3′→5′外切酶活性，无校对活性因此在PCR中每2╳104个核苷酸中有可能掺入1个错误核苷酸，这对一般的PCR产物分析不会有多少影响，但将PCR扩增产物用于分子克隆时，需使用更准确的DNA聚合酶 在100μL反应体系中，一般需Taq DNA聚合酶0.5-5单位，酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少Taq DNA酶可在-20℃贮存至少6个月 2. PCR反应的缓冲液：反应的缓冲液： PCR的缓冲液一般制成10×，含有：500m mol/L KCl;100m mol/L Tris-HCl(pH8.3)；15m mol/L MgCl2;0.1% 明胶。

使用时要稀释10倍其中Tris-HCl可维持反应体系的pH，KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性，明胶可保护酶不变性失活，Mg2+能影响Taq酶的活性，影响反应的特异性和扩增DNA的产率，因此要将Mg2+浓度调至最佳 3.3.引物：引物： PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计引物设计一般遵循以下原则： (1)引物长度 一般为15-30b15-30b，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到不需要的扩增产物  (2)G+C含量 G+C含量一般为40%-60%40%-60%引物的G+C含量和引物Tm值应该协调，按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值 (3)碱基的随机分布 引物中4种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现引物自身不应存在互补序列，以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合两引物之间也不应有互补性，尤其是避免3′端的互补而形成引物二聚体，使靶序列的扩增量下降 (4)引物浓度 引物的浓度一般为0.1-0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。

4.dNTP4.dNTP：： dNTP常用的浓度为20-200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误参入率，适当的低浓度会提高反应的精确度另外，dNTP是磷酸根的来源，会与Mg2+结合，也应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系 5.5.模板模板DNADNA 模板可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、扩增后的DNA、cDNA等，RNA的扩增需要首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此PCR反应前用机械剪切或用稀有限制酶酶解基因组DNA，以提高产量 PCR反应中模板加入量一般为102-105拷贝的靶序列 6.温度循环参数 变性温度一般为在90-95℃变性所需的时间取决于DNA的复杂性，一般用94℃ 30s对模板DNA进行变性，过高的温度及过长的时间会降低Taq酶的活性引物的退火温度通过Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般55-80℃ 30s。

延伸温度选在70-75℃之间，此时Taq酶活性最高延伸反应的时间根据扩增片段的长度而定，一般1 kb以内延伸1 min，更长的片段需相应延长时间PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度，一般20-30次循环次数越多，非特异性产物也越多 ( (三三)PCR)PCR技术的扩展技术的扩展 典型的PCR经过一定的调整可用于特殊的研究工作，使PCR技术扩展到分子生物学的各个方面 ，较常用的技术扩展有：1. “1. “巢式巢式””PCR(nested PCR)PCR(nested PCR) 先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR 技术即巢式PCR第一次扩增所用引物称外引物(outer-primer)，第二次扩增作用的引物称内引物(inter-primer) 进行“巢式”PCR可将外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，用外引物进行时，采用较高退火温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后，只需降低退火温度即可直接进行内引物的PCR扩增这种PCR技术被称为“中途进退式”PCR(drop-in-drop-out PCR)。

 “巢式”及“中途进退式”PCR主要用于极少量模板的扩增 2.2.复合复合PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR) 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体此外也常用于多点突变性分子病的诊断3.3.不对称不对称PCR(asymmetric PCR)PCR(asymmetric PCR) 两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR不对称PCR可制备用于核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针等4.4.反转录反转录PCR(reverse transcription PCR)PCR(reverse transcription PCR) 由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛应用5.5.涂片涂片PCR(slide-PCR)PCR(slide-PCR) 直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR。

涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR检测 6.6.反向反向PCR(inverse PCR)PCR(inverse PCR) 扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR在反向PCR中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切后再进行PCR反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增7.7.锚定锚定PCR(anchored PCR)PCR(anchored PCR) 用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3′端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建8.8.修饰引物修饰引物PCRPCR 为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR技术称为修饰引物PCR此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5′末端，当PCR完成后可对产物直接进行检则 PCR在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。

第二节 核酸的分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物中最常用的基本技术之一其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链此杂交过程是高度特异性的 杂交的双方是待测核酸序列及探针待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA将核酸从细胞中分离纯化后可在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交 用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测常用的标记物是放射性核素，近年来也发展了一些非放射性标记物检测这些标记物的方法都是极其灵敏的 核酸分子杂交技术被广泛应用于基因克隆的筛选和酶切图谱制作、基因组中特定基因序列的定量和定性检测、基因突变分析以及疾病的诊断等方面它的应用也大大推进了分子生物学的迅猛发展，如基因芯片就是分子杂交技术进一步扩展的产物 核酸的原位杂交有广阔的应用前景，但现时操作较繁，较易出现假阳性，故本节只介绍膜上印迹杂交 一、探针的种类与选择一、探针的种类与选择 核酸分子探针可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等种类。

探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结果的分析1.1.基因组基因组DNADNA探针探针 几乎所有的基因片段都可被克隆到质粒或噬菌体载体中，获得大量高纯度的DNA探针 但在选择此类探针时，要特别注意真核生物基因组中存在的高度重复序列(如人类基因组中的Alu序列)要尽可能使用基因的编码顺序(外显子)作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序2.cDNA2.cDNA探针探针 cDNA中由于不存在内含子及其它高度重复序列，因此是一种较为理想的核酸探针但cDNA探针不易获得，从而限制了它的广泛应用另外，还须注意其中的poly(dT)产生的非特异性杂交问题3.RNA3.RNA探针探针 mRNA作为探针的优点是：①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因此杂交温度可提高10℃左右，杂交的特异性更高；②RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交较少；③杂交后可用RNase将未杂交的探针消化掉，从而使本底降低但是，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，mRNA作为探针，其来源极不方便因此，一般通过cDNA克隆、甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti-mRNA样探针。

4.4.寡核苷酸探针寡核苷酸探针 寡聚核苷酸探针可根据需要随心所欲地用DNA合成仪合成，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带的不利影响寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其Tm，因此它特别适合于基因点突变分析；另外，由于序列的复杂性降低，因此杂交所需时间也较短需要注意的是，短寡核苷酸探针所带来的标记物较少，特别是非放射性标记时，其灵敏度较低，因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，以采用较长的探针为好 设计寡核苷酸序列用于分子杂交时应遵循以下几个原则： (1)(1)探针长度：探针长度：一般要求10-50bp设一段寡核苷酸的长度为n，则其在DNA中随机出现的频率(P)为1/4n因此可以计算出，分析大肠杆菌基因只需12碱基长的寡核苷酸探针(大肠杆菌基因组DNA含量为4×106bp,12-mer碱基顺序的随机频率为1.7×10-7)；而对于人基因组则需17或18-mer(人基因组DNA含量为2.9×109bp,17-mer和18-mer碱基顺序随机出现的频率分别为1.7×10-10和6.9×10-10)。

过短则特异性降低，过长则不仅合成较困难，而且延长杂交时间 (2)G∶C(2)G∶C对含量对含量: :应为40%-60%，超出此范围会增加非特异性杂交 (3)(3)一定不要含有探针内部互补顺序：一定不要含有探针内部互补顺序：即不应有＞4bp的碱基反向互补配对，否则会形成探针内部“发夹”状结构 (4)(4)避免有同一碱基的连续出现：避免有同一碱基的连续出现：不可＞不可＞4 4个，如个，如-GGGGG--GGGGG- (5)(5)最好用计算机与已知的各种基因序列进行同源性比较：最好用计算机与已知的各种基因序列进行同源性比较：如果此寡核苷酸序列与非靶基因序列有70%以上的同源性或连续8个以上的碱基序列相同，则最好不用，重新设计 二、标记物的选择二、标记物的选择 放射性核素是灵敏度极高的标记物，但易污染环境，需严格的防护措施，故近年来开发了不少非放射性标记物，有些已达到相当高的灵敏度，只是一些试剂价格较昂贵，目前，放射性核素仍广泛使用，但非放射性标记物的使用率正在日益增高 (一一) )放射性核素标记物的选择放射性核素标记物的选择 常用于标记核酸探针的放射性核素有32P、3H和35S，有时也用14C、125I以及131I等。

各种放射性核素的适用范围是由其物理特性所决定的，表5-1列举了上述几种放射性核素的物理特性  1.1.3232P P：： 释放的β-粒子能量高，穿透力较强，放射自显影所需时间短，灵敏度高，被广泛应用于各种滤膜杂交以及液相杂交中，特别适合于基因组中单拷贝基因的检测 其缺点是半衰期短，射线散射严重，导致X-片上带型轮廓不清，有时会影响到结果的分析32P大多是以32P-NTP或32P-dNTP的形成掺入探针的要注意有些标记方法需要标记α-位磷酸(如切口平移法)，有些则需要标记γ-位的磷酸(如多核苷酸激酶末端标记法)另外还须注意其比放射活性，在同等放射活性时，比放射活性越高，核苷酸分子的浓度(摩尔数)越低，一般常用的比放射性为3000Ci/m mol,全长均匀标记时，比放射性可低一些 2.2.3535S S：： S原子可以取代磷酸分子上的一个氧原子，从而形成35S标记的核苷酸分子核苷酸分子结构上的这种改变，对于大多数核酸修饰酶(如DNA和RNA聚合酶、激酶和 磷酸酶等)的活性没有太大的影响，是其适宜的反应底物，可以直接替代32P-标记的 核苷酸用于探针标记，其标记程序毋需改变。

也有报导表明，这种结构上的改变会抑制DNA 聚合酶的活性，使其掺入速率下降 35S的放射性较强，但β-粒子能量较低因此其检测灵敏度较32P稍低 由于其射线的散射作用较弱，在X-光胶片上成影分辨率较高另外，35S的半衰期较32P长，是其受欢迎的原因之一 35S放射的粒子穿透力极弱，一张薄薄的保鲜膜即可将之阻断，这是在放射自显影时所必须注意的问题 3.3.3 3H:H: 3H释放的β-粒子能量极低，散射极少，因此在感光乳胶上的成影分辨率最高，本底较低，最适用于细胞原位杂交，但放射自显影所需时间较长目前亦有较多的人用32P和35S代替3H进行原位杂交3H的另一优点是半衰期长，标记的探针可存放较长时间反复使用4.4.125125I I和和131131I I：： 碘放射性同位素分辨率较高，放射自显影曝光时间较短，在7 0年代曾被广泛用于核酸探针的标记，但随后由于高放射活性的α-32P-(d)NTP的研制成功，加上碘同位素易挥发，吸入人体会引起内照射，现已极少被采用(二二)放射性核素的探测放射性核素的探测1.1.盖革计数管盖革计数管 盖革管是核素实验室必备的探测仪器，主要用途是随时进行放射性污染的 探测、放射自显影曝光时间的估计及探针柱层析时探针部位的跟踪等。

虽然其对放射活性的测量并不十分准确，但也可对标记探针放射活性进行粗略估计盖革管为一抽尽空气的玻璃管，并充入两种气体，一是惰性气体如氩、氖、氦等，可在α射线或β射线作用下电离放电产生电脉冲另一种是淬灭气体，如乙醇、乙醚、溴、氯等，其作用是防止计数管在一次放电后发生连续放电密封管的中间有一钨丝作为阳极，玻璃内壁涂有一层导电物质作为阴极 由玻璃制成的厚端窗管可用于高能β-粒子(如32P)的检测，测定效率甚至可达到100%而对于14C那样的低能β-射线，可用云母或聚酯膜制成的纤维薄端窗管由于γ-射线不能直接产生电离作用，因而其对γ-射线的探测效率极低应注意盖革管记录的 数据并不是放射性核素的真实衰变数(每分钟衰变数dpm,或每秒衰变数dps)，而是在单位时间内记录的脉冲数，以cpm(每分钟脉冲数)或cps(每秒钟脉冲数)表示 2.液体闪烁计数器(简称液闪) 闪烁计数的原理是：粒子射到某种闪烁体上时，闪烁体产生荧光，然后经光电倍增管转变为电子脉冲而被记录下来液闪计数的闪烁体是一些有机溶剂(如甲苯、甲氧苯、二甲苯等)，溶剂经射线轰击产生波长极短的荧光，然后经第一荧光剂 (如PPO，2,5-二苯基恶唑)和第二荧光剂(如PO-POP，1,4-二［2-(5-苯基恶唑)］-苯)逐级转换成为长波荧光，从而被光电倍增管有效地探测到。

液闪的计数效率很高，是现代分子生物学实验室中主要的辐射探测器3.放射自显影 具体方法在本节第六部分介绍 （三（三)放射性核素的防护放射性核素的防护 放射卫生防护条例规定，放射性核素可分为极毒、高毒、中毒和低毒四类131I属于高毒类，32P、35S为中毒，而3H和14C则属于低毒类因此 在进行放射性核素操作时决不能掉以轻心，否则有可能造成严重的人身伤害和环境污染 (1)(1)工作场所：工作场所：核素操作应在专用的核素室内进行核素工作实验室应分为清洁区、中间区( 缓冲室)和活性区三部分室内墙壁、天花板、地面应光滑无缝、不透水室内应有良好的通风设备放射性污水应有专用的下水系统，水龙头开关最好采用长臂式或脚踏式  (2) (2)个人防护：个人防护：进行核素操作应穿戴专用的工作服、工作帽、防护手套、口罩、防护鞋及防护眼镜尽量在有机玻璃防护屏后进行操作操作台上应铺有吸水纸操作结束后要及时清 理用具，并用盖革管对工作台、器械及身体进行探测，确保无污染长期进行核素操作的工作人员应定期进行体检及化验检查孕妇严禁进行核素操作 (3) (3)废物处理：废物处理：放射性核素废物必须贮存在专门的容器内，并用铅玻璃屏障。

容器上必须有 标签，注明核素种类、剂量及使用日期对于32P等半衰期小于15天的放射性废物可 采用放置法处理，即放置约10个半衰期的时间，然后倒入下水道或按一般废物处理半衰期长的应集中收集交由专门单位再进行焚化法或掩埋法处理  (4) (4)意外事故的处理：意外事故的处理：少量放射性物质污染工作台或地面，应立即用吸水材料吸干，然后再用清水反复擦洗，但应注意不要使污染面积扩大，直到放射性接近本底如污染严重，则经 初步控制污染后，应暂时封闭现场放射性物质污染皮肤时，应立即用吸水纸吸去污物，然后用软毛刷和肥皂反复刷洗，直到放射性接近本底，刷洗过程中也应注意不要使污染范围扩大，切不可擦破皮肤如误服放射性物质，应立即进行嗽口、洗胃和催吐等方法处理，以促使其在未吸收前排出体外，另外应根据不同的放射性核素选择不同的促排剂以加速已吸收的放射性物质排出体外 (四四)非放射性标记物的选择非放射性标记物的选择 根据其检测方法：非同位素标记物可分为以下几类： (1) (1) 半抗原：半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。

 (2) (2) 配体：配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗生物素蛋白(strep tavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测 (3) (3) 荧光素：荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交 (4) (4) 化学发光：化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以象放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后研究的主流 (5) (5) 光密度或电子密度标记物：光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可在光镜下或电镜下进行观察  三、探针的放射性核素标记三、探针的放射性核素标记1.1.切口平移法切口平移法 线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为切口平移法的模板 首先，极微量的DNase I在Mg2+的存在下，在DNA链上随机形成单链切口利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除同时，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性的催化下，在切口的3′末端-OH上合成新的DNA单链。

如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸(如32P-dCTP)，则这些标记的核苷酸将 替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射活性的DNA探针 2.随机引物法 随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意序列的核酸杂交，形成DNA聚合酶的引物，目前市售的随机引物为6个核苷酸残基的各种可能排列顺序共46=4090种将变性后的模板DNA与随机引物混合复性，在大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)催化下合成新链，反应液中有［α-32P］-dNTP时，即可形成放射性核素标记的DNA探针加入的随机引物越多，探针合成的起点越多，得到的探针会越短3.末端标记法 利用T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶、KlenowDNA聚合酶、末端转移酶等可以标记探针的一端，标记活性较切口平移法和随机引物法低得多，一般很少用作分子杂交的探针，主要用 于DNA序列测定，故不作详细介绍4.探针的纯化 探针标记后，有时需要用凝胶过滤法除去未掺入的dNTP等小分子，收集含探针的第1锋，有时还需用酒精沉淀探针 四、探针的非放射性标记四、探针的非放射性标记 按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有两种类型，一种是预先已连接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等。

另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上后一类标记过程更为简单，可能是今后研究发展的主流 1.酶促标记法 目前应用最广的非同位素标记物是生物素(biotin)生物素可通过一条碳链臂与UTP或dUTP 嘧啶环的5位碳相连，连接物的碱基配对能力不变，而且仍然是许多DNA修饰酶的良好底物碳链臂可长可短，但臂长为16或11个原子时，效果为佳除dUTP外，一系列生物素标记的dATP和dCTP也已被研制和应用德国Boehringer Mannheim公司生产的地高辛(digoxigenin)标记物也已被逐步推广使用 生物素和地高辛标记的dNTP可以用切口平移法、随机引物法及末端移酶末端标记法等进行核酸探针(包括DNA、RNA和寡核苷酸探针)的标记但要注意，由于生物素等标记物是连接在碱基上，而不是磷酸基团，因此不能用多核苷酸激酶法进行末端标记 2.化学标记法 化学标记法是将标记物与化学性质较活泼的基团相连，在一定条件下使活泼基团活化而与核苷酸的特定部位共价结合，常用的有： (1)光敏生物素(photobiotin)：与核酸探针混合后，在一定条件下用强可见光照射10-20分钟，即可与探针相连，形成的标记探针可在-20℃下保存8-10个月，是目前常用的标记法 。

标记时DNA制品不能用Tris溶液溶解，不能含有蛋白质，且小片段探针标记效率偏低 (2)胞嘧啶生物素标记法：单链核酸中的胞嘧啶在亚硫酸氢钠作用下形成亚硫酸化中间物，然后与乙二胺经转氨基作用形成胞嘧啶胺衍生物，再与生物素酯反应形成生物素酰胺衍生物 (3)生物素肼标记法：生物素肼在磺酸的催化下与单链核酸中的胞嘧啶反应，形成N4-生物素标记的衍生物 (4)酶的直接交联：将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶通过化学方法直接交联到核酸探针上，通过酶促反应显示探针的位置五、膜上印迹杂交的条件选择五、膜上印迹杂交的条件选择 膜上印迹杂交操作的基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变再用标记核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记探针的位置由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其含量与大小有关印迹的基本知识在第二章已经介绍，这里主要介绍杂交条件的选择。

 DNA分子杂交实质上是双链DNA变性和具同源序列的两条单链复性的过程 1.1.变性变性 凡能破坏氢链和碱基堆积力，增大双链两侧磷酸基负电荷斥力的物理和化学手段均可引起核酸变性DNA热变性的Tm值多在85-90℃，影响Tm的主要因素有： (1) DNA (1) DNA的碱基组成：的碱基组成：DNA中(G+C)%愈高，Tm值也愈高在1譙SC溶液中，两者之间的关系可用以下经验公式来表示： (G+C)%=(Tm-69.3)2.44(G+C)%=(Tm-69.3)2.44 或或Tm=0.41 (G+C)%+69.3Tm=0.41 (G+C)%+69.3 (2) (2) 溶液的离子强度：溶液的离子强度：在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，消除静电斥力，使DNA双链的稳定性增加，Tm值亦升高 (3) pH (3) pH值值: : pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。

在高pH值下，可使碱基失去形成氢链的能力当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完全变性Southern杂交时，0.5mol/L的NaOH可使DNA在室温下变性 (4) (4) 变性剂变性剂: : 变性剂可以干扰碱基堆积力和氢链的形成，因此可以降低Tm值常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50%的甲酰胺可以使Tm值降低30℃ 2.2.复性复性 复性的速度受到诸多因素的影响： (1) DNA (1) DNA的浓度：的浓度：DNA浓度高则单链间碰撞的机率高，复性速度快 (2) DNA (2) DNA的大小：的大小：大分子DNA扩散速度较慢，难于形成正确配对，复性速度较慢 (3) (3) 温度：温度：温度升高，有利于DNA变性而不利于复性；而温度过低，则少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以继续寻找正确配对适宜的复性温度是Tm-25℃ (4) (4) 离子强度：离子强度：离子强度过低，不利于复性，复性时常采用0.15-1.0mol/L溶液 (5) DNA (5) DNA分子的复杂性：分子的复杂性：DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。

3.3.杂交体系的建立杂交体系的建立 分子杂交过程，实质上是DNA的复性过程上述复性原则也同样适用于杂交建立杂交体系应考虑到以下几个因素： (1) (1) 离子强度离子强度：一般杂交体系中离子强度为5×或6×SSC (1×SSC为0.15mol/L NaCl和0.015mol/L柠檬酸钠) (2) DNA (2) DNA浓度浓度：DNA浓度愈高，复性速度愈快为保证足够的DNA浓度，除应加入足够的DNA量外，还应尽量减少杂交体积，一般以每平方厘米滤膜面积加50-100μL杂交液为宜 (3) DNA (3) DNA探针的长度探针的长度：探针片段越大，其扩散的速度越慢，因此复性的速度越慢 (4) (4) 温度：温度：选择适当的杂交和洗膜温度是核酸分子杂交成败最关键的因素之一通常杂交反应在低于Tm值15-25℃温度下进行以下经验公式对于帮助判断Tm值很有用处： Tm=81.5℃+1.66 lgM+0.41(G+C)%-500/n-0.6(Tm=81.5℃+1.66 lgM+0.41(G+C)%-500/n-0.6(甲酰胺甲酰胺%)%)其中M为Na+摩尔浓度；n为探针的复杂性(没有重复序列时，复杂性即为探针的长度，单位为b)。

 一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行 杂交后的洗膜温度一般应低于Tm值5℃-12℃对于多数杂交体系而言，最典型的终洗膜强度为0.1×SSC(0.015mol/L Na+)在55℃下洗膜 选择杂交温度还应考虑以下几点： ① 错配率每增加1%，Tm值相应下降1-1.5℃ ② RNA/DNA杂交体的稳定性较高，Tm值应增加10-15℃RNA/RNA杂交体的Tm值应增加20-25℃因此，采用RNA探针时，加入适量的甲酰胺以降低Tm值是必需的 ③ 由于寡核苷酸探针的特殊性，杂交温度的选择显得更为重要上述公式同样也适用于寡核苷酸探针Tm值的估计，但下述公式更为方便： Tm=4℃ Tm=4℃ ×× G G∶∶C C对数量对数量+2℃+2℃××A∶TA∶T对数量对数量 如20-mer寡核苷酸，含50%(G+C)，则其Tm值为： Tm=4℃×10+2℃×10=60℃ 寡核苷酸探针杂交反应一般在低于Tm值5℃下进行，如上述探针杂交应在55℃进行寡核苷酸探针杂交温度不易很好控制，应进行预试验反复摸索。

 (5) (5) 杂交时间杂交时间：一般应为C0t1/2的1-3倍，下列经验公式可作为杂交时间选择的参考： YZ/(5YZ/(5××10X) 10X) ××2 = 2 = 小时小时/ C/ C0 0t t1/21/2  式中X为探针DNA的量/μg，Y为探针DNA的复杂性，即片段的大小(kb)；Z为杂交体系的体积(mL ) (6)(6)预杂交预杂交: 为减少非特异性杂交反应，在杂交前应进行预杂交，将非特异性DNA位点封闭常用的封闭物有两类：一类是变性的非特异性DNA，大多采用鲑鱼精子DNA(salmon sperm DNA)或小牛胸腺DNA(calf thymus DNA)；另一类是一些高分子化合物，除也可封闭DNA上的非特异位点外，更主要的是封闭滤膜上的非特异性位点，减少其对探针的非特异性吸附作用，一般多采用Denhardt氏溶液(含聚蔗糖400,聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白)，近年来有人采用Blotto系统(即脱脂奶粉代替Denhardt's溶液)，也取得了较好的效果 (7) (7) 硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖: 能促进DNA链间的缔合，其微粒的表面可吸附DNA探针分子，从而使DNA接触面积增大，有利于杂交。

10%硫酸葡聚糖可使杂交速度提高10-100倍也有人使用聚乙二醇(PEG，Mr6000-8000)和聚丙烯酸(polyacrylic acid,Mr90 000)，其优点是粘稠度较低需降低杂交背景时，不可使用硫酸葡聚糖 六、杂交信号的检测六、杂交信号的检测( (一一) )放射自显影放射自显影 利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影其基本步骤是： 1.用放射性墨水在滤膜上一定部位进行标记，以利于以后的定位因为滤膜的放射性本底一般可使X光片上将滤膜清晰地显示出来，此步骤一般可以省略 2.将滤膜用保鲜膜包好，置暗盒中在暗室中，将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上，光面向上再压一至两张X光片，再压上增感屏后屏，光面向X光片盖上暗盒，置-70℃曝光适当的时间 3.根据放射性的强度曝光一定的时间后，在暗室中取出X光片，显影，定影如曝光不足，可再压片重新曝光 (二二)非放射性核素探针的检测非放射性核素探针的检测 除酶直接标记的探针外，其它非放射性标记物并不能被直接检测，而需经两步反应将非放射性标记物与检测系统偶联第一步称为偶联反应，第二步称为显色反应。

1. 1. 偶联反应偶联反应 大多数非放射性标记物是半抗原，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联另一类非放射性标记物如生物素，作为抗生物素蛋白(卵白素，avidin)的配体，可通过亲合法进行检测avidin是一种糖蛋白，有4个与生物素结合的位点，与生物素的亲合力极高但是，由于体内存在内源性生物素的干扰，同时，由于avidin为糖蛋白，中性环境下带正电荷，易与其他带负电荷的生物大分子非特异性结合，导致假阳性结果近年来使用的链亲和素不是糖蛋白，等电点为中性，较少形成非特异性结合，特异性较高 2.2.显色反应显色反应 通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行杂交信号的检测常用的检测物质与方法有以下几类： (1) (1)酶法检测酶法检测：这是最常用的检测方法通过酶促反应使其底物形成有色反应产物最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶可使其作用底物BCIPBCIP(5-bromo-4-chloro-4-indolyl phosphate)脱磷并聚合，释放出的H+使NBTNBT(nitroblue tetrazolium,硝基蓝四氮唑)还原而形成紫色化合物。

 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化下列反应： AH2+H2O2→2H2O+A 因此可采用一种能产色的氢供体化合物作为HRP的底物，在HRP的作用下氧化脱氢，从而在杂交部位生成不溶于水的有色物质，除可用于滤膜杂交外，亦可用于原位杂交的显微镜下检测通常用作HRP的显色底物有DABDAB(3，3′-diaminobenzidine,二氨基联苯胺）和TMBTMB(3,3′,5,5 ′-tetramethylbenzidine,四甲基联苯胺)此外还有人采用phenylenediamine,O-dianisi dine(3,3′-dimethoxybenzidine)，以及4-chloro-1-naphthol等 DAB DAB经HRP催化反应后形成一种红棕色沉淀物TMBTMB的反应产物为蓝色，较之红棕色的DAB产物更易于观察，特别是在显微镜下而且DAB是一种致癌物质，而TMB无致癌性 (2)(2)荧光检测法荧光检测法 荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测荧光素FITC(isothiocyanate)应用最广，罗丹明(rhodamine)类也常被采用，但荧光强度较低。

Rhodymenia phycoerythrin(RPE)是一种重要的荧光蛋白(fluorescent phycobiliprotein)，它的吸收光谱广，荧光强度高(大约为荧光素的20-50倍)(3)(3)化学发光法化学发光法(chemiluminescence) 化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应应用化学发光法检测固相支持物上的DNA杂交体最为适宜目前最有前途的是辣根过氧化物酶催化luminol(3-aminophthalate hydrazine)伴随的发光反应(4)(4)电子密度标记电子密度标记(detection electron-dense labels)： 利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检测主要适合于细胞原位杂交检测 第三节 基因克隆 基因克隆的技术路线大致包括以下几个程序： ①分离制备待克隆的DNA片段(目的DNA)； ②在体外连接目的DNA片段和载体； ③重组DNA分子转入宿主细胞； ④筛选、鉴定阳性重组子； ⑤重组子的扩增 一、目的基因的来源一、目的基因的来源1.1.基因组基因组DNADNA的非特异性断裂的非特异性断裂 超声波处理基因组DNA可得到300bp左右的随机片段，高速组织捣碎器，控制一定的条件也能得到不同大小的DNA片段，如将高分子量DNA 1500r/m捣碎30分钟，可得到大约8kb的DNA片段。

由机械处理产生的DNA片段末端不一，断点随机，条件难以掌握，所以目前较少使用这种方法2.2.染色体染色体DNADNA的限制性内切酶酶解的限制性内切酶酶解 Ⅱ型限制性内切酶可专一识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端若载体DNA与插入片段用同一种内切酶消化，可以直接进行连接 内切酶识别的DNA顺序长短与降解后DNA产生的片段大小有直接关系若识别顺序为4个碱性对，则该顺序在DNA链上出现的机率为44，即在碱基随机排列的前提下，每256个碱基对就有一个切点对于识别6个核苷酸的限制性内切酶，其顺序出现的频率为46(4096)，可获得较大的DNA片段，也可用于DNA文库的建立 3.3.通过通过mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA 基因组DNA中重复顺序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比较困难用mRNA反转录成cDNA，得到相应的双链cDNA，再进行克隆，获得较完整的连续编码顺序，容易在宿主细胞中表达 除建立cDNA文库以外，对于一些高丰度表达、容易纯化的蛋白质，可以直接通过该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再分离该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆，从而直接获得该特定基因的克隆，这是用染色体DNA难以达到的克隆效果。

4.4.人工体外合成人工体外合成DNADNA片段片段 随着体外合成DNA的技术日渐完善，合成DNA的长度不断加长一些小分子生物活性多肽，可以通过人工合成编码顺序插入载体后，转化细菌进行表达分子较大的基因，可以通过分段合成，然后连接组装成完整的基因目前已经合成了人胰岛素A、B链基因和干扰素基因，并成功表达，制备成商业产品5.5.聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)(PCR)扩增特定基因片段扩增特定基因片段 对于有部分了解或完全清楚的基因，可以通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段，然后进行克隆操作唯一的要求是，对基因片段两侧的序列了解清楚 （1）用斑点杂交选择特定的克隆6.用用cDNA文库选文库选择特定的基因择特定的基因（2）用已知的氨基酸序列选择特定的克隆（3）差别杂交：若A组细胞用生长因子处理，B组细胞不作处理，将其中的一组mRNA逆转录成cDNA文库，与另一组的mRNA杂交，或将两组的mRNA均逆转录成cDNA再进行分子杂交，不能形成杂交双链的是二者差异表达的基因4）扣除杂交：比差别杂交省时、省力、灵敏度高，基本原理如图所示。

二、常用的克隆载体二、常用的克隆载体 基因克隆多用大肠杆菌为宿主细胞，常用的载体有质粒，λ噬菌体和M13噬菌体，构建基因组文库，cDNA文库的载体和表达载体将在本章有关部分概述1.1.质粒质粒 质粒是染色体外的小型环状DNA，能自主复制，并含有少量基因，常用的有：(1) pBR322(1) pBR322： pBR322是由几个质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的克隆载体，分子的长度为4363bp具有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记pBR322共有24种限制性内切酶的单一识别位点，其中7种酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,XmaⅢ,Nru I)的识别位点位于四环素抗性基因内部，2种酶(ClaI,HindⅢ)的识别位点存在于这个基因的启动子内部所以在这9个限制性位点上插入外源DNA通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活3种酶(scaI,PvuI,PstI)在氨苄青霉素抗性基因(ampr )内具单一的识别位点，在这3个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活若将外源基因插入tetr基因，将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌， 则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长，而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。

适合于双抗生素选择20世纪70年代早期主要利用天然质粒，1977年Bolivar等构建成功pBR322,1982年Viera和 Messsing构建成功pUC系列质粒，随后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世(2) pUC18/pUC19(2) pUC18/pUC19： pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体，含有来自pBR322质粒的复制起点(ori)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌β半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码α肽链的基因，在lacZ基因中有一个多克隆位点(MCS)区段当外源的DNA片段插入到这些克隆位点使α互补链破坏时，形成的是无活性的β-半乳糖苷酶，被转化的大肠杆菌细胞，在X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) -IPTG (异丙基硫代β-D-半乳糖苷)培养基上形成白色菌落，而没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在X-gal-IPTG培养基上形成蓝色菌落pUC质粒载体比pBR322具有更小的相对分子质量，而且由于rop基因的缺失(其基因产物ROP蛋白，控制质粒复制)，使得其拷贝数大增，每个细胞可达500-700个拷贝，因此由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。

pUC18和pUC19的唯一差别是多克隆位点的方向相反Xgal可被β-半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴-4-靛兰，IPTG可诱导β-半乳糖苷酶α-链的合成 适合于蓝白选择2λ2λ噬菌体噬菌体 λ噬菌体的基因组是长度约为50kb的线性双莲DNA分子在其两端，各有一条由12个核苷酸组成的互补粘性末端当λ噬菌体DNA进入寄主细胞后，线性DNA分子通过粘性末端的碱基配对而结合，形成环状DNA分子这种由粘性末端结合形成的双链区段为cos位点 现用的λ噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的改建之后的常用载体有两类：①插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如λgt10、λgt11;②替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段可被外源插入的DNA片段取代，如charon4、charon10、charon35插入型载体只能插入较小的外源DNA片段(＜10kb)，而替换型载体能插入较大的外源DNA片段(20-24kb左右)当重组体DNA分子大于λ噬菌体基因组105%或小于75% 时，重组噬菌体的活力会大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重组体DNA分子长度应控制在包装限度范围内。

 λ噬菌体重组体分子不具有抗生素抗性选择标记，主要是依据噬菌斑的形态学特征和Xgal-IPTG显色反应来筛选重组子cI基因的存在将使λ噬菌体进入溶源状态，因此在培养基上形成的是混浊型的噬菌斑cI基因失活或缺失的λ噬菌体在培养基上形成清亮型噬菌斑根据这个形态学特征可筛选λ重组体分子 许多λ载体，如charon2、λgt11含有编码β半乳糖苷酶基因lacZ(其中引入多克隆位点)由这种载体感染的大肠杆菌lac-菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，寄主细胞就会在Xgal-IPTG培养基上形成无色噬菌斑，如果在替换型载体的可替换区段含有lacZ基因序列，也会出现同样结果 3.酵母人工染色体4.M13噬菌体 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，具有长约6400bp的闭合环状单链(+)DNA，它只感染带有F因子所编码的性纤毛的大肠杆菌，所以是雄性大肠杆菌特有的噬菌性M13(+)链DNA进入大肠杆菌寄主细胞，在细胞内酶的作用下，以(+)链DNA为模板，合成互补的(-)链DNA，从而形成双链复制型DNA(RF DNA)。

)链转录成M13的mRNAM13基因Ⅱ编码的蛋白质作用于RF DNA正链的特定位点，切割形成切口，以环形的M13(-)链为模板，合成M13(+)链DNA，当DNA复制叉环绕负链模板整整一周时，在基因Ⅱ产物的作用下，新合成的(+)链DNA被切去，并环化形成M13基因组 M13是一种非溶菌的噬菌体，在实验中所观察到的混浊型噬菌斑，是由于感染的细菌生长速度比未感染的细菌明显下降所致RF DNA复制大量单链(+)DNA，可被外壳蛋白包裹成病毒颗粒分泌到寄主细胞外由于M13能以双链DNA形式存在于细胞中，并以单链DNA形式分泌到大肠杆菌以外，所以适合于在Sanger设计的双脱氧DNA序列分析中制备单链模板 在M13系列中，用得最多的M13mp18、M13mp19，这一对载体中含有大肠杆菌一段包括乳糖操纵子在内的β半乳糖苷酶基因lacZ序列，并可在此序列中导入多克隆位点，当有外源DNA片段插入时，可利用蓝白噬菌斑的颜色反应来初步筛选重组的DNA分子M13mp18和M13mp19的区别是在多克隆位点的限制性内切酶的酶切位点顺序相反 M13mp载体中的克隆片段超过1kb时，在M13噬菌体的增殖过程中会发生缺失。

三、三、DNA分子的体外连接分子的体外连接 DNA分子的连接方案要有利于重组子的形成，有时需要对载体或目的基因的末端进行改造， 现时常用的连接方案主要有：1.1.全同源黏性末端的连接全同源黏性末端的连接 若DNA插入片段与适当的载体存在同源黏性末端，则连接十分方便同源黏性末端包括同一种内切酶产生的黏性末端和不同的内切酶产生的互补黏性末端，后者连接成的DNA顺序不能再被原内切酶识别，而不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来 全同源黏性末端连接存在的问题是载体容易自身环化降低重组率，插入片段可双向插入或多拷贝插入，目的基因需表达时，需采用定向克隆技术 2.2.平末端连接平末端连接 T4 DNA连接酶可连接平末端，5′突出的黏性末端，可以用Klemow酶5′→3′聚合酶活力将另一链的3′末端填平成平头末端3′突出的黏性末端可以用T4 DNA聚合酶的3′→5′外切酶删切成平头末端，平末端连接可以在DNA链的末端产生新的酶切位点，从而扩大了平末端连接的应用范围平末端连接的效率较低，易形成双向插入和多拷贝插入，适当加大T4 DNA连接酶浓度，降低ATP浓度，载体5′端脱磷酸处理，加入适量的PEG可提高连接效率。

3.3.定向克隆定向克隆 使外源DNA片段定向插入到载体分子中的方案叫定向克隆定向克隆是利用DNA分子两个末端的不同内切酶位点进行的，对于一些表达型重组子，外源DNA片段在载体启动子下游的正向插入，是成功表达的基本条件同时，定向克隆可有效地限制载体DNA自身环化 定向插入要求载体DNA分子的两个末端不能互补，只能与外源DNA分子的相应末端连接，达到这一要求的DNA分子末端有两种形式：①DNA两端为非同源互补的黏性末端(黏-黏)②DNA分子一侧为黏性末端，一侧为平末端(黏-平) “黏-黏”末端可用不产生相同黏性末端的两种内切酶作用产生，重组连接效率非常高，是重组方案中最有效、简捷的途径 “黏-平”末端可用一个产生平末端的内切酶与一个产生黏性末端的内切酶联合消解DNA产生；也可用一个产生黏性末端的内切酶先消解DNA，然后填平或删切黏性末端的突出部分，使之变成平末端，再用另一个产生黏性末端的内切酶消化DNA分子在两个黏性末端中一个能互补，另一个不能互补的情况下，将不能互补的黏性末端修饰改造成平末端，再进行重组是一条很好的重组方案 4.4.利用连接子连接利用连接子连接 DNA连接子是等摩尔数的两种双链平末端DNA短片段，二者之间有互补关系，且其中含有一个或多个限制性内切酶位点。

 连接子的作用主要是在DNA平末端添加新的内切酶位点以产生黏性末端，便于DNA片段之间的连接，是亚克隆技术及基因文库构建中一项常用的技术 连接子大小一般为8-12bp，接受连接子的DNA片段必须是平末端，对于黏性末端则需预先修饰成平末端 由于连接子的分子小，很容易达到DNA平末端连接所需的高末端浓度，一般连接子的末端浓度必须高于靶DNA末端浓度2-3倍4-20μmol/L连接子末端浓度，可以驱动T4 DNA连接酶的连接反应，因此靶DNA的浓度就可以较低 靶DNA片段中，若存在与连接子相同的内切酶位点，在添加连接子前，必须预先用相应的甲基化酶进行修饰，防止内切酶切割连接子时降解靶DNA片段 市售的连接子有两种形式，即5′末端磷酸化的连接子和5′末端去磷酸化的连接子前者能在T4 DNA连接酶催化下进行连接反应后者需要用T4多核苷酸激酶在其5′端磷酸化后，才能成为连接酶的合适底物 使用连接子进行亚克隆操作包括三个步骤：①将连接子连接于外源DNA片段两侧一平末端上 ；②用相应的内切酶切割连接子；③含新黏性末端的外源DNA片段与相应的线性载体DNA分子连接。

5.5.利用适配子连接利用适配子连接 DNA适配子是人工合成的寡聚脱氧核糖核苷酸链，它含有某种黏性末端的突出顺序，不需用内切酶切割而产生通过与其它适配子或连接子互补配对，形成双链DNA，再与靶DNA连接在DNA重组中，可适用于各种类型的DNA末端之间的连接，且操作较使用连接子简单 当今，由于适配子及连接子技术的发展，就重组技术而言，几乎不存在不能连接的DNA分子  四、四、 重组子导入受体细胞重组子导入受体细胞 在基因克隆技术中，将重组质粒导入细菌称转化，将重组后的噬菌体、病毒等导入细胞称转导，重组子导入真核细胞将在基因表达一节中介绍1.1.转化转化 受体菌用Ca2+处理后呈感受态，其细胞膜出现变化，使DNA易于进入细胞内重组质粒与Ca2+处理过的感受态受体菌保温，重组体可进入受体菌增加培养基降低Ca2+ 浓度，基因便可表达质粒的转化率大约为105-107转化体/μg DNA，一般较小的质粒转化率较高 用电击法转化细菌操作简单，转化率可高达109-1010 /μg DNA ，此法需特殊设备，且电压高，脉冲时间长时，细菌会有相当高的死亡率2.2.转导转导 重组噬菌体DNA进入经Ca2+处理的感受态细菌，转导率可达105-106噬菌斑/μg DNA，若用λ噬菌体的外壳蛋白包装重组体，转导率还可大大提高。

五、重组子的筛选五、重组子的筛选 不同的克隆载体及相应的宿主系统，其重组子的筛选、鉴定方法不尽相同，常用的有以下几 类( (一一) )针对遗传表型改变的筛选法针对遗传表型改变的筛选法 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因的表达失活，会导致细菌的某些表型改变，通过琼脂平板中添加一些相应筛选物质，可以直接筛选鉴别含重组子的菌落操作非常简单，是筛选阳性重组子的第一步1.1.插入失活双抗生素对照筛选插入失活双抗生素对照筛选 如前述pBR322质粒，若外源DNA插入tetr基因，则先将转化菌接种到含氨苄青霉素的平板培养基上，凡生长的菌落均含有质粒再用无菌牙签将这些菌落接种到含四环素平板培养基 的对应位置，凡不能生长者均含有重组质粒，扩大培养这些菌落，即可扩增重组质粒 2.2.插入表达筛选插入表达筛选 有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负控制序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达如pTR262质粒，其tetr基因上游存在Cl基因的负调控序列，CI基因可以抑制tetr基因的表达，当外源DNA片段插入CI基因时，tetr基因阻碍解除而表达，阳性重组子为tetr表型，而质粒本身为tets表型，故在四环素平板中，只有含外源DNA插入片段的阳性重组的转化菌才能生长成菌落。

3.β-3.β-半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选 通过插入失活lacZ基因的载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等它们的共同点是载体上携带一段细菌的基因lacZ，它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽 ，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15 基因型，重组子中基因插入使α-肽基因失活不能形成α-互补作用，在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为无色噬菌斑或菌落，载体自身环化后转化的细菌为兰色噬菌斑或菌落这种筛选方式的操作非常简单，只是X-gal和IPTG等试剂价格较高 (二二)分析重组子结构特征的筛选法分析重组子结构特征的筛选法1.1.快速裂解菌落鉴定分子大小快速裂解菌落鉴定分子大小 从平板中直接挑取菌落裂解后，不需要内切酶消化，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较迁移率，初步判断是否有插入片段存在，本方法适用于插入片段较大的重组子初步筛选2.2.内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定 对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA ，用相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。

3.Southern3.Southern印迹杂交印迹杂交 为了进一步确定DNA插入片段的正确性，在内切酶消化重组子，凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性核素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所需的靶基因片段 4.PCR4.PCR筛选重组子筛选重组子 一些载体的外源DNA插入位点两侧，存在恒定的序列，用相应的引物对小量抽提的质粒DNA进行PCR分析，不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA顺序分析对于原核或真核系统表达型重组子，其插入片段的序列正确性是非常关键的，故有必要对重组子进行序列测定，DNA序列分析现多采用自动测序仪完成5.5.菌落菌落( (或噬菌斑或噬菌斑) )原位杂交原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交技术是先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄膜或琼脂平板上，再转移到另一硝酸纤维素薄膜上，用核素标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆菌落本方法能进行大规模操作，一次可筛选5×105-5×106个菌落或噬菌斑，对于从基因文库中挑选目的重组子，是一项首选的方法。

六、基因组文库的构建六、基因组文库的构建 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体，真核生物染色体DNA经限制性内切酶部分酶解后，用氯化铯密度梯度离心或制备型凝胶电泳分级分离，得到长度适于插入载体的片段，将其与载体连接，感染适当的宿主菌，得到一组含有不同DNA片段的重组颗粒 构建基因组文库常用的载体是λ噬菌体和黏粒载体，λ噬菌体载体能接受的插入片段为24kb ，黏粒载体能接受的插入片段约为35-45kb由于有的真核基因比较大，如人凝血因子Ⅶ基因长达180kb，不能作为单一片段克隆于这些载体之中，所以要用容量更大的载体系统，如酵母人工染色体克隆系统(yeast artificial chromosome cloning system,YACS)，YACS可以克隆200-500kb的DNA片段，对于分离和鉴定哺乳动物基因组大片段，它是一个重要的新手段  黏粒载体本身长4-6kb，具有质粒和λ噬菌体两种载体的性质，能像质粒一样复制及转化细菌，在细菌中其增殖与质粒复制一样，产生的重组子是菌落而不是噬菌斑，同时也具有λ噬菌体的cos位点，能与λ噬菌体一样在体外被包装成病毒颗粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因组文库要比在λ噬菌体中困难得多，只有在靶基因过大，不能作为单个DNA区段在λ噬菌体载体中克隆增殖，或者要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时，才使用黏粒载体。

 λ噬菌体载体是目前使用最多的构建基因组文库的载体，置换型λ噬菌体载体的容量为20-24kb，以λ噬菌体为载体构建基因组文库有以下几个基本步骤：1.载体的制备 λDNA载体如EMBL系列，λ2001、λDASH和charon38-charon40等都可用于基因组文库的构建如λEMBL载体，左臂20kb包括噬菌体从头到尾部的基因，右臂9kb有复制起始点及其他必需的基因，它的5′端都是由12个核苷酸组成的单链，且单链是互补的，可以形成环状λDNA 或λDNA串联体，这个序列称为cos位点，中央片段带有red和gem基因，是可以被置换的 制备λEMBL载体的左右臂可用BamHI酶处理载体，产生左右臂和中间片段其中的中间片段可用EcoRI酶切为3个片段，两侧的寡核苷酸片段有一端为BanHI黏性末端，用异丙醇可沉淀除去，中间片段不含BamHI黏性末端，无需除去所得左右臂可与具BamHI黏性末端的外源基因构成重组体 2.2.基因组基因组DNADNA的制备的制备 基因组DNA的片段要足够大，其长度是被克隆的片段的4倍时，部分酶解形成的片段才能有80%被克隆，若用λDNA做载体，插入片段的大小在20kb左右，染色体DNA＞100kb就可以了，如果用黏粒做载体，插入片段为35-45kb，染色体DNA就要大于200kb，制备就很困难了。

要得到足够大的DNA片段，除了整个操作要避免DNA酶的污染外，还要注意将机械剪切力控制到最小得到的高相对分子质量DNA一般用sau3A或MboI进行酶解先进行预实验，摸索产生20kb左右DNA比例最大的酶解条件，在此条件下酶解大量的DNA，得到的DNA可以用氯化铯密度梯度离心或低熔点琼脂糖电泳，前者得率较高，但对实验条件要求较高，操作麻烦，后者得率较低，但容量较大，可用于大小范围较广的DNA片段，分辨力更佳 3.3.载体与外源载体与外源DNADNA的连接的连接 首先要用预实验确定载体与外源DNA的合适比例，一般用0.1-1.0μg的噬菌体DNA两臂，按照载体两臂与插入片段的摩尔数比在1∶0.5-1∶3的范围加入不同量的插入片段进行连接反应，用0.5%琼脂糖凝胶电泳选择最佳的比例然后用所选的条件完成载体与外源DNA的连接 4.4.重组重组DNADNA的体外包装的体外包装 重组λDNA在体外进行有效包装后，感染大肠杆菌的效率比λDNA直接感染大肠杆菌的效率要高的多市场上有制备好的包装提取物出售，将其与重组λDNA在适当条件下混合即可完成包装如果所需包装提取物用量很大，购买时花费太多，也可以自己制备，但制备过程较繁琐。

5.5.文库的检测、扩增和保存文库的检测、扩增和保存 Clark和Carbon提出了任一DNA序列在文库中出现的几率： N=ln(1-p)/ln(1-f) p是希望得到该段DNA的几率，f是插入片段长度与基因组总长度的比值若插入片段为17kb，染色体的长度为3×109kbp为99%，则 N=[ln(1-0.99)]/{ln[1-（1.7×104）/（3.0×109)]}=8.1×105  即从8.1×105个病毒颗粒中得到长度为17kb的DNA的几率是0.99一般来说，实际克隆要达到理论计算值3倍以上，形成的基因组文库才较为完整和有代表性 将包装液适当稀释，转化受体菌，测定噬菌斑，若能达到合适的滴度(即每毫升包装液可形成噬菌斑的数目)，我们实际上已经得到一个原始的原因组文库 原始的基因组文库可以扩增放大，但扩增有可能造成某些克隆的丢失或重组，故扩增次数应尽量少一些 包装液或扩增产物离心除去沉淀，上清液中加几滴氯伤，4℃可以保存数年 七、七、cDNA文库的构建文库的构建 将真核细胞内全部mRNA转录成cDNA并将双链cDNA(dscDNA)和载体连接，由此得到的cDNA克隆群体称为cDNA文库。

cDNA文库可用于研究真核生物基因的结构和功能，比较cDNA和基因组DNA序列的不同，可以确定内含子序列和转录后加工的问题，由于cDNA不像基因组DNA那样有内含子，可以在原核生物中表达，所以在基因工程中，cDNA文库往往比基因组文库更有用 1.mRNA1.mRNA的制备的制备 要获得高质量的mRNA必须创造一个无RNA酶的环境RNA酶耐高温、耐酸碱，在人体的汁液，唾液，环境中的灰尘，各种器皿和制剂中均有存在因此在RNA的提取过程中，任何与RNA接触的器皿和溶液都必须做去RNA酶的处理，全部操作过程中都要戴一次性手套并经常更换近年来常用的提取总RNA的方法是异硫氰酸胍苯酚法，异硫氰酸胍是一种强变性剂，可迅速溶解蛋白质，使细胞结构破坏，核蛋白从核酸上脱落，4mol/L的异硫氰酸胍和β硫基乙醇联用，可灭活RNA酶，用苯酚和蛋白酶K去除蛋白质，得到的总RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA被洗脱，经过两次oligo(dT)纤维素柱层析，就可得到较纯的mRNA对于高丰度的mRNA来说，合成和克隆cDNA之前无需进一步纯化特定的mRNA，而要得到低丰度尤其是极低丰度mRNA的拷贝，就要构建足够大的cDNA文库，或者通过分级分离富集目的mRNA来减少耗资可观、工作量大的建库和筛选工作。

2.cDNA2.cDNA第一链的合成第一链的合成 来自禽成髓病毒和鼠白血病病毒的逆转录酶均可用于cDNA第一链的合成，前者具RNA酶H活性，最适温度42℃，较高的反应温度可消除mRNA二级结构对逆转录的阻碍作用，但RNA酶H活力会抑制cDNA的合成，限制其长度后者RNA酶H活力较低，可得2-3kb mRNA的全长cDNA,但要用氢氧化甲基汞破坏mRNA的二级结构，临合成cDNA第一链时，用过量的巯基试剂使氢氧化甲基汞从RNA上解离 用12-18b的oligo(dT)为引物合成cDNA的效率较高，但得到＞3kb的全长cDNA较困难，6b的oligo(dT)为引物可得到较长的cDNA 3.cDNA3.cDNA第二链的合成第二链的合成 在反应体系中加入RNA酶H，切割cDNA/mRNA杂交体中的mRNA造成切口和缺口产生的RNA片段可以作为cDNA第二链合成的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I作用下，合成cDNA第二链，用大肠杆菌DNA连接酶(该酶需要NAD+)封闭切口再加入T4DNA聚合酶处理，其3′→5′外切酶活性去除单链3′突出端，聚合酶活性填补了3′羟基凹端，最终产生平末端，可与接头相连。

4.cDNA4.cDNA的克隆的克隆 cDNA与载体的连接，质粒的转化或噬菌体的包装及转染，重组体的筛选等，均可从前述基因克隆和基因组文库构建中介绍的方法中，选择适当的方法来完成为了获得足够大的库容量，连接前可用凝胶过滤或低熔点琼脂糖凝胶电泳除去合成不完全或降解的DNA及过量的接头，并用磷酸酶处理载体，避免载体之间的连接或载体的自身环化 第四节 基因表达 一、原核生物的表达载体 原核细胞中表达外源基因可产生融合型和非融合型表达蛋白非融合蛋白未与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起，具有非常近似于真核生物体内蛋白质的结构，生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质，缺点是容易被细菌蛋白酶破坏将带有起始密码ATG的真核基因插到原核启动子和SD序列的下游，组成1个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，可得非融合蛋白融合蛋白的N末端由原核DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码，含原核细胞多肽的融合蛋白可避免细菌蛋白酶的破坏表达融合型蛋白时，为了得到正确的真核蛋白，在插入真核基因时，其阅读框架与融合的DNA片段的阅读框架要一致，翻译时，才不至于产生移码突变  表达载体的构建比较困难，但市场上已有不少构建好的表达载体可供选择，常用的有：1.非融合型表达载体pKK223-3 pKK223-3具有1个强的tac(trp-lac)启动子。

该启动子是由trp启动子的-35区域和lac UV-5 启动子的-10区域，操纵基因及SD序列组成紧接tac启动子的是1个取自pUC8的多克隆位点( polylinker)，使之很容易把目的基因定位在启动子和SD序列后；在多克隆位点下游还包含1 个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子，载体其余部分是由pBR322组成的在使用pKK233-3质粒时，要相应地使用LacI宿主，如JM105一个具有PKK223-3质粒类似结构的载体被用于表达Lambda CI基因时，经IPTG诱导产生的蛋白，占可溶性细胞抽提液中总蛋白的18-26%由此可见，在需要获得大量的基因产物时，pKK223-3确实是1种非常有用的工具  用原核生物对真核基因进行非融合表达，容易得到较大的表达量，但表达产物不易形成正确的折叠，不能被糖基化，容易被分解，或形成包含体，裂解包含体时，蛋白质会变性，需要复性，才能得到有活性的蛋白质融合lac和trp的启动子，可被IPTG诱导，是最常用的原核启动子2.分泌型克隆表达载体PINⅢ系统 PINⅢ是以pBR322为基础构建的，带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂蛋白基因)启动子。

在启动子的下游有Lac UV-5的启动子及其操纵基因Lac阻遏子的基因(Lac I)，使目的基因的表达很容易调节在转录控制顺序的下游为人工合成的高效翻译起始顺序(SD顺序及ATG)编码信号肽的顺序，取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa( 外膜蛋白基因)在信号肽编码顺序下游紧接着的是1段人工合成的多克隆位点片段，其中包含3个单酶切点：EcoR I、HindⅢ和BamHI为了使不同密码子阅读框架的目的基因片段，都能和信号肽密码子阅读框架正确衔接，分别合成了适用于所有3种密码子阅读框架的多克隆位点片段使用这3种多克隆位点片段的载体分别称之为：pIN-ompA1,pIN-ompA2和pIN-ompA3 用这个分泌型载体来表达金黄色葡萄球菌的核糖核酸酶A(staphylococal nuclease A)，分泌到细胞间质中产物达300mg/L，占细胞总蛋白量的9%为了进一步提高载体的表达效率， 把IPP启动子的-35区的DNA顺序AATACT改为TATACT，结果目的基因的表达产量提高到1500mg/L，占细胞总蛋白量的42%，其中有40%的基因产物是经过信号肽酶加工而成的成熟蛋白 3.融合蛋白表达载体pGEX系统 Pharmacia公司的融合蛋白表达载体系统有3种载体pGEX-1T，pGEX-2T和pGEX-3X和1种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B。

载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子(tac)及Lac操纵基因、SD顺序、LacI阻遏蛋白基因等这类载体与其它表达载体不同之处是SD顺序下游就是谷胱苷肽巯基转移酶基因，使克隆的外源基因与谷胱苷肽巯基转移酶基因相连当进行基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体这个载体系统具有如下优点：①可诱导高效表达；②表 达的融合蛋白质纯化方便；③使用凝血酶(thrombin)和Xa因子(factor Xa)就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽；④用EcoR I从λgt 11载体中分离的基因可直接插入pGEX-1λT中 二、用于原核细胞表达的外源基因 用原核细胞表达真核基因存在的主要问题是原核细胞缺乏真核细胞转录后的加工系统，转录产物中的内含子不能切除，成熟的mRNA不能形成；缺乏真核细胞翻译后的加工系统，合成的肽链无法加工因此，目的基因最好只编码成熟蛋白质或多肽目前有3种办法可以得到符合要求的目的基因 1.从真核细胞中分离mRNA，在体外反转录成cDNA，到原核表达载体进行表达 2.如果欲表达的蛋白质或多肽的分子较小且氨基酸序列已知，根据遗传密码可以设计并利用DNA合成仪合成1段“全基因”，进行克隆和表达。

3.设计并合成两段引物，以cDNA为模板，采用PCR技术扩增得到目的基因 第一种方法是最早使用的，不足之处在于不能除去编码蛋白质前导肽或信号肽的核苷酸序列同时，向原核表达载体克隆目的基因时也常常遇到麻烦后两种方法是最近几年兴起的，它克服了第1种方法的不足，在目的基因的克隆和表达方面具有明显的优势 三、提高表达水平的措施(一)提高翻译水平1.调整SD序列与ATG之间的距离 SD顺序与ATG的距离不同，IL-2表达水平可相差2-2000倍如在Lac启动子带动下，其距离为7个bp时，IL-2的表达水平为2581单位，而距离为8个bp时，表达水平降至不足5个单位 这表明根据不同的启动子，调整好SD序列与起始密码ATG的距离，对提高外源基因的表达水平非常重要2.用点突变的方法改变某些碱基 有资料表明，紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差15-20倍 另外，在不改变编码的氨基酸顺序的条件下，尽量用强密码子取代弱密码子，确有可能提高表达水平但是，大量的研究表明，含有弱密码子的真核基因是能够在大肠杆菌获得高效表达的可见，密码子的使用问题并非是影响外源基因在大肠杆菌表达水平的决定因素。

3. 增加mRNA的稳定性 多数情况下，细菌mRNA的半哀期短，仅为1-2分钟，而外源基因mRNA的半衰期可能更短若能增加mRNA的稳定性，则有可能提高外源基因的表达水平研究表明，大肠杆菌的重复性基因外回文(repetive extragenic palindronic.REP)顺序具有稳定mRNA的作用，能防止3 ′→ 5′外切酶的攻击因此，外源基因下游插入REP顺序或其它具有反转重复顺序的DNA片段可起到稳定mRNA，提高表达水平的作用(二)减轻细胞的代谢负荷 外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节目前常用的方法有：1.表达载体的诱导复制 减轻宿主细胞代谢负荷的一个重要措施，是当宿主菌生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中质粒DNA的复制质粒pCI101是温度控制诱导DNA复制的最好例子，用此质粒转化宿主菌， 25℃时宿主中仅有10拷贝，宿主细胞大量生长；但当温度升高到37℃，质粒大量复制，每个细胞中拷贝数增加到1000个。

2.诱导表达 将宿主菌的生长和外源基因的表达分开成为两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷最常用的方法一般采用温度诱导或药物诱导如采用λPL启动子时，在32℃时，CICI基因基因有活性，产生阻遏物抑制λPL启动子下游基因产物的合成，此时，宿主菌大量生长当温度升高到42℃时，CICI基因失活基因失活，阻遏蛋白不能合成， PL启动子解除阻遏，外源基因得以高水平表达而应用tac启动子，则将将LacILacI基因基因克隆在表达质粒中当宿主菌生长时，LacI产生的阻遏蛋白与Lac操纵基因结合，阻遏了外源基因 的转录及表达，此时，宿主菌大量生长当加入诱导物(如IPTG)时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达一般而言，化学诱导比温度诱导更为方便和有效 ，并且将相应的阻遏蛋白基因直接克隆到表达载体上，比应用含阻遏蛋白基因的菌株更为有效 (三)提高表达蛋白的稳定性 在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往不够稳定，常被细菌的蛋白酶降解，因而会使外源基因的表达水平大大降低因此，提高表达蛋白的稳定性，防止细菌蛋白酶的降解是提高外源基因表达水平的有力措施1.表达融合蛋白 表达融合蛋白的优点和基本方法已如前述。

得到的融合蛋白必须切除原核多肽，常用的化学法(如溴化氰)特异性较差，条件较剧烈，酶法特异性较高但切割效率较低2.采用某种突变菌株保护表达蛋白 大肠杆菌蛋白酶的合成依赖于次黄嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆菌蛋白酶合成受阻，从而使表达蛋白得到保护Baker发现大肠杆菌htp R基因的突变株也可减少蛋白酶的降解作用Bull利用lon和htp R双突变的菌株表达出稳定的生长素C另外，T4噬菌体的Pin基因产物是细菌蛋白酶的抑制剂，将Pin基因克隆到质粒中并转化大肠杆菌，细菌的蛋白酶便受到抑制，外源基因的表达产物受到保护有人应用此法 ，成功地在大肠杆菌中表达了人β干扰素 3.表达分泌蛋白 表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施在原核表达系统中，人们研究比较多的主要是大肠杆菌 大肠杆菌主要由四部分组成：胞质、内膜、外膜及内外膜之间的周间质一般情况下，所谓 “分泌”是指蛋白质从胞质跨过内膜进入周间质这一过程而蛋白质从胞质跨过内、外膜进入培养液的情况较为少见，被称为“外排”以区别于“分泌”。

 蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个条件： (1)信号肽：信号肽序列对于分泌蛋白质是必要的，其长度一般为15-30个氨基酸残基结构上都有以下特征：①在氨基末端有1-3个带正电荷的氨基酸，往往是精氨酸或赖氨酸残基 ；②有2个疏水的核心区，含亮氨酸或异亮氨酸残基，位置可以从带正电荷的氨基酸延伸到含切割位点的区域；③含有能被信号肽酶水解的切割位点，这个位点常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或丝氨酸之后 原核和真核的信号肽序列在结构和功能上均具有相似性细菌的信号肽可以在真核细胞中起作用，真核的信号肽序列也能在原核细胞中起作用 (2)成熟蛋白质有与分泌相关的氨基酸序列：信号肽对蛋白质的分泌是必须的，但仅有信号肽还不能完成分泌过程，很多在大肠杆菌中分泌的蛋白质需要其成熟体中的氨基酸序列来引导其到达最终的目的地缺少相应的氨基酸序列，分泌就不能正常进行  (3)细胞中的转运机制：目前已发现了信号肽酶I、信号肽酶Ⅱ等近20种蛋白质参与了原核细胞的分泌过程与真核细胞不同的是，在大肠杆菌中，蛋白质的合成和分泌过程有些是同步的，有些则是先翻译后分泌的分泌的能量来源于高能磷脂键的水解或质子的推动力。

 欲在大肠杆菌中表达分泌型外源蛋白，必须首先考虑目的蛋白被分泌的可能性其次，要考虑到在应用分泌蛋白技术路线时，要防止目的蛋白的某些序列被信号肽酶错误识别，以致把目的蛋白切成碎片进而部分或大部分失去生物活性因此，要慎用这一技术路线 (四)包含体对表达的影响 以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包含体(inclusion body)包含体的形成可防止蛋白酶对表达蛋白的降解，有利于分离表达产物 但包含体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性在包含体内，水解酶不能对所有的表达蛋白质都起作用，这样就可能产生N-末端带有甲硫氨酸的目的蛋白质衍生物，因此，目的蛋白往往要通过加工才能形成天然蛋白 包含体的形成基因和形成过程还不十分清楚有人认为包含体的形成不仅与表达蛋白的生成速率高、无足够时间使肽链折叠及表达蛋白的高浓度有关，而且还与培养宿主菌的温度、pH 、某种金属离子不足等因素有关大肠杆菌表达外源基因时所形成的包含体大小一般为0.5-1.0μm，比重在1.2左右包含体与细胞质内的蛋白质物理化学性质不同因此，将菌体破碎(如超声波、匀浆等)后，离心就可得到包含体。

密度梯度离心后则可得到高纯度的包含体包含体通常不溶于水，加入强蛋白质变性剂后方可溶解根据包含体中蛋白质种类的不同，通常用6-8mol/L盐酸胍或9-10mol/L尿素溶解包含体有时不用蛋白质变性剂，而采用pH2.0-4.5的酸性溶液使包含体溶解 表达蛋白中含有半胱氨酸时，在包含体内可形成二硫键(S-S)菌体破碎后，由于空气的氧化作用，表达蛋白分子间或与杂蛋白质也可形成二硫键这种情况下，用变性剂溶解包含体时，需加入二硫苏糖醇(DTT)、硫基乙醇等还原剂使表达蛋白质完全还原 在包含体被溶解后，需要降低变性剂的浓度使表达蛋白质复性常用的方法有稀释法、透析法、凝胶过滤及各种层析方法等在蛋白质含有多个半胱氨酸时，为了形成正确的二硫键，常在复性时加入还原型谷胱苷肽和氧化型谷胱苷肽等氧化还原缓冲液为了抑制蛋白质聚集，防止分子间错误的二硫键形成，常使变性剂保持在1-2mol/L之间当分子内二硫键少时，可不用氧化还原缓冲液，而通过搅拌，依靠空气的氧化作用，恢复表达蛋白的正确构型  总之，为了提高蛋白质复性效率，在溶解包含体时应：①尽量提高包含体的纯度；②尽量使包含体充分溶解，并且使形成包含体的蛋白质完全还原，必要时加入还原剂。

在复性过程中应：①分阶段减低变性剂浓度，并使变性剂保持在适当浓度；②必要时使用氧化还原缓冲剂；③应将复性蛋白浓度、pH、温度及盐的种类、离子强度等调整到最适状态 外源基因在酵母中的克隆和表达 在酵母中表达真核基因，表达产物容易形成正确的折叠和糖基化，但不容易形成较大的表达量通常将目的基因插入穿梭载体，在大肠杆菌中扩增后，再转入酵母菌进行表达用酵母菌表达的不少蛋白质已经作为基因工程产品，产生了很好的经济效益和社会效益典型的穿梭质粒,分别含有酵母和细菌的起始位点整合载体（yeast integrating plasmid)无酵母的复制起点，必须整合到染色体中才能稳定存在附加体质粒（yeast integrating plasmid)有酵母的复制起点，在酵母细胞中以高拷贝存在复制质粒（yeast integrating plasmid)有酵母的自主复制序列（autonomous replicating sequence,ARS)，在酵母细胞中以中等拷贝存在含着丝粒（CEN)的质粒（yeast centromere- containing plasmid)含有ARS和CEN，在酵母细胞中以单拷贝稳定存在。

酵母人工染色体（yeast artificial chromosome)含有ARS和CEN和TEL端粒(telomere)，能以微型染色体存在，可以克隆超过100kb的DNA片断酵母的表达载体必须含有可以被RNA聚合酶Ⅱ识别的强启动子，如可诱导型的GAL（半乳糖激酶）、PHO5（碱性磷酸酯酶），组成型的ADH1（醇脱氢酶）、PGK（磷酸甘油激酶）、GPD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）等的启动子四、外源基因在哺乳动物细胞中的表达 哺乳运动细胞表达体系可进行转录后和翻译后加工，表达产物提纯工艺简单，因而有很大的发展潜力(一)哺乳动物细胞基因转移的选择标记 如何从成百万个细胞群体中检出极少数转化细胞，是构成哺乳运动基因转移系统的一个关键目前常用的方法有：1.胸苷激酶基因(tk)选择系统 胸苷激酶(Thymidine Kinase,TK)能催化胸苷(T)转变成dTMP，进而生成dTTPTK选择系统将含有tk+基因的表达载体导入tk-宿主细胞，再用含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸苷(T)的培养基培养细胞，其中A为叶酸类似物，可阻断dATP、dGTP的合成，及dUMP到dTTP的转化，但H可合成IMP，再由IMP合成dATP和dGTP，含有载体的tk+细胞能利用T合成dTTP，故可合成DNA使细胞存活，不含载体的tk-细胞不能利用T合成dTTP，无法合成DNA使细胞死亡。

该系统中的tktk+ +基因基因能报告载体的导入，称报告基因，培养基中含有H、A和T，故将这种选择方法称做HAT选择法 2.二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统 dhfr-表型的细胞由于不能合成四氢叶酸，在不含外源胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中，细胞会因胸腺嘧啶及嘌呤的饥饿而死亡但将dhfr基因转入缺陷型细胞后，细胞能合成四氢叶酸，进而使细胞的核酸合成能够进行，所以能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中存活，而未转入dhfr基因的细胞则被选择淘汰 dhfr基因选择系统需要dhfr-表型的受体细胞，这就限制了它的使用范围但这一选择系统有一个明显的优点，就是它可以使外源基因得到扩增当培养基中逐渐增加氨甲蝶呤(met hotrexate,MTX)的浓度时，随着细胞对MTX抗性的增加dhfr基因与外源基因均明显扩增，进而使外源基因的表达产物增加3.新霉素抗性选择系统 新霉素可以干扰原核生物的核糖体，使其蛋白质合成不能正常进行，而不影响真核细胞核糖体新霉素的一种类似物G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性细菌的新霉素抗性基因(neo)与真核启动子连锁时就能获得有效的表达。

neo基因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活所以，当细胞表达了neo抗性基因后，就能在含G418的选择培养基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型 4.氯霉素乙酰转移酶基因检测系统 氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)可催化氯霉素发生乙酰化作用，从而使其失去活性真核细胞不含内源的CAT酶活性，但其启动子却可引发外源CAT基因的表达带有cat基因的载体转化到哺乳动物细胞后，就会合成CAT所以只要在细胞中检测到CAT的活性，即可肯定它含有cat载体，为了测定转化细胞的cat的活性，在转化后的47-72小时，离心收集细胞，并制备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶A和14C标记氯霉素进行孵育，如果细胞中有CAT存在，氯霉素就被乙酰化，作薄层层析分离，便可将氯霉素和乙酰化的氯霉素分开然后通过放射自显影技术测定乙酰化的产物此法十分灵敏，精确 (二)哺乳动物的表达载体1.SV40载体 猴空泡病毒40(simian vacuolating virus 40,SV40)载体基因组只有5243bp，序列已确定，基因组为共价闭合环DNA(cccDNA)，酶切图谱及各种功能的基因定位均已详细了解。

病毒DNA较易制备，但是，用SV40重组病毒转染细胞时，随着病毒的繁殖，细胞会裂解，这对基因工程中的应用是很不理想的SV40 DNA分子小，插入的DNA不能大于2500bpSV40 DNA的早期功能区插入外源DNA，存在致癌的隐患，为此，人们对病毒载体进行了改造，同时插入tk, dhfr,neo,cat等标记基因，构成了适用于不同目的的表达载体pSV 载体就是以SV40为基础构建的一群载体的总称 2.腺病毒载体 腺病毒(adenovirus,Ad)易于培养纯化，其基因组为线性双链DNA，可插入较大的外源DNA片段，最大的可达约7kb，且可在宿主细胞内大量扩增，宿主细胞范围广泛不足之处是Ad在 细胞内复制时可大量释出壳体蛋白，容易引起宿主细胞介导的免疫反应，使转导的细胞遭到免疫攻击而被破坏3.痘苗病毒载体 痘苗病毒(vaccinia virus)与天花病毒(variola virus)亲缘关系密切，接种痘苗病毒可获得对天花的高度免疫性，因此，不少科学家致力于构建重组痘苗病毒作为预防疾病的活疫苗，现已成功地构建出了乙型肝炎病毒表面抗原、流感病毒亚单位、狂犬病毒糖蛋白等一系列 重组痘苗病毒活疫苗。

痘苗病毒是双链DNA病毒，DNA长度达180kb宿主范围广泛，可插入的外源DNA最大可达25kb，但其基因组DNA分子大，因而不易操作 (三)外源DNA导入哺乳动物细胞的方法1.磷酸钙转染技术 使DNA和磷酸钙形成共沉淀物，黏附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就可被细胞捕获在制备DNA磷酸钙共沉淀物时，要注意控制好pH，使形成的颗粒大小适中2.电穿孔转染技术 在高压电脉冲作用下，使细胞膜上出现微小的孔洞，外源DNA可穿孔而入操作需专用仪器，要注意控制好最大电压和电击时间 3.脂质体载体法 脂质体(liposomes)是一种人造膜制备包装DNA的脂质体，一般用逆相蒸发(reverse phase evapolation)技术，因为此法可产生大型的、包装着高效DNA的单层膜脂质体载体包装脂质体的SV40DNA的感染性，至少要比其裸露DNA搞出100倍，在加入脂质体之后，用高浓度的聚乙二醇(PEG)或甘油处理，可使脂质体DNA感染性提高10-20倍，脂质体的制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜(polycarbonate filter)灭菌，用它包装的DNA在4℃可长期保存不失活性，可保护DNA免受核酸酶的降解作用。

以脂质体为载体的基因转移过程通常是先用PEG处理培养的动物细胞，使之易于吸收周围培养基中的脂质体正常情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右，若加甘油或DMSO等促进因子，吸收量还可增多 4.DEAE-葡聚糖转染技术 二乙胺乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran,DEAE-dextran)是一种高分子多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA其机理可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞作用DEAE-dextran与磷酸钙共沉淀法比 较有3点不同：①它一般用于克隆基因的瞬时表达，不易形成稳定转化细胞系；②由于它对细胞有毒性作用，所以，某些细胞系(如BSC-1,CV-1,COS等)用该转染技术时转染效率很高，有些类型的细胞则效率不高：③DEAE-dextran可用于转染小量DNA DEAE-dextran转染主要有2种不同的方法一种是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran复合物后，再用来处理细胞；另一种是受体细胞先用DEAE-dextran溶液预处理，然后再与转染的DNA接触。

 影响DEAE-dextran转染效率的因素主要有DEAE-dextran的浓度和DEAE-dextran处理细胞的时间一般用高浓度(1mg/mL)短时间(30分钟到1.5小时)或用低浓度(250μg/mL)长时间(8小时)两种方法来进行转染由于DEAE-dextran对细胞有毒性，所以采用低浓度长时间的方法比较可靠 5.显微注射法用显微注射仪可将外源DNA直接注射到受体细胞中这种方法需大型仪器，操作难度大，主要用于转基因动物研究中对卵细胞的操作，故不作详细介绍 人类疾病的基因治疗人类疾病的基因治疗 基因治疗的基本条件：病因明确的单基因病；仅限于体细胞治疗；可提取病人的靶细胞，基因操作后再回输病人体内；治疗效果要大于对病人的危害；要用动物实验充分证明其疗效和安全性 基因治疗的策略：基因矫正；基因置换；基因增补；基因失活 基因治疗的途径：间接体内疗法（多用逆转录病毒）；直接体内疗法（多用腺病毒） 基因治疗面临的困难：多数疾病的分子机制不明；基因表达调控的机制不明；治疗方案多采用间接体内疗法，细胞体外培养过程中的变化，回输体内的去向不够明确；外源基因随机整合的潜在危险值得关注。

逆转录病毒介逆转录病毒介导的基因治疗导的基因治疗腺病毒介导的基因治疗五、转基因植物 植物细胞具有全能性，故由基因工程改造过的单细胞可再生为转基因植物目前，转基因植物的主要应用是将单个或一小簇基因转入植物，获得有价值的性状抗虫、抗除草剂、抗病、抗衰老、抗不良环境的转基因植物已取得很好的经济和社会效益，将转基因植物用于提高植物园艺价值和农业价值，生产植物次生代谢物和研究植物的生理生化及发育，均取得不少突出的成就 1.用Ti质粒进行植物转化 土壤农杆菌携带的Ti质粒(tumor-inducing plasmid)为150-200kb的环型DNA(大小因菌株 而异)，其中有一段12-24kb的TDNA能在vir基因表达产物的协助下整合到植物染色体中 将Ti质粒改建为克隆载体需删除一些对克隆有害或无用的基因，插入选择性标记基因(报告基因)，复制起点，合适的启动子和克隆位点，但改造后的克隆载体一般不含完整的vir基因，故T-DNA不能整合到受体细胞的染色体中解决这一问题的途径有两条：(1) 双元载体系统： 双元载体含有大肠杆菌和农杆菌的复制起点，首先用该载体在大肠杆菌中完成基因的克隆，然后将之转入含有修饰Ti质粒的农杆菌中，该质粒的TDNA缺失或部分缺失，但含有完整的vir基因，可辅助双元载体的TDNA整合到植物染色体中。

(2) 共整合载体系统： 该系统中Ti质粒含有目的基因而缺失vir基因，另一穿梭质粒含有vir基因，两种质粒中均含有一段同源DNA片段，二者发生同源重组，即可形成既含有外源基因，又含有vir基因的共整合载体，使外源基因能够整合到植物染色体中 土壤农杆菌介导的基因转移是目前获得转基因植物的最常用方法但用于单子叶植物成功率不高，近几年这一转移方式用于单子叶植物已获得一些成功，看来这一方法仍有很大发展余地 编码多种转编码多种转移和整合作移和整合作用相关的酶用相关的酶和蛋白质和蛋白质T-DNA右端边缘右端边缘T-DNA左端边缘左端边缘胭脂碱合成胭脂碱合成酶酶-新霉素新霉素抗性基因抗性基因 使用共整合载体时，常用三个菌株配合：具有辅助转移质粒的大肠杆菌；具有携带目的基因质粒的大肠杆菌；具有onc-Ti质粒衍生的受体载体的根瘤土壤杆菌菌株乙酰丁香酮乙酰丁香酮*冠瘿碱冠瘿碱*2.病毒衍生载体 烟草花叶病毒(TMV)可用来构建载体，一般将外源基因置于外壳蛋白基因启动子调控之下，或利用外壳蛋白基因的连读获取外壳蛋白外源蛋白的融合蛋白这一系统用于表达α天花粉蛋白和病原虫的抗原决定簇已获得成功。

3.将基因转入植物的物理方法 一类方法是消化植物细胞壁，得到的原生质体用聚乙二醇(PEG)法、磷酸钙法、电击法等导入外源基因，存在的问题是由原生质体发育成植株比较困难另一类方法是基因枪技术，即将DNA包裹在直径1-4μm的金粉或钨粉上，再用火药爆炸力或压缩氦气将颗粒以300－600m/s的速度射入细胞此法转化率高，但获得稳定整合个体的效率较低 第五节 转录调控研究技术 基因表达调控按其发生顺序可人为地分为：转录前、转录、转录后(翻译前)、翻译及翻译后等几个部分，其中转录调控最为重要人们对转录调控机制的研究已颇具规模，并提出了不少很好的研究手段 一、基因功能状态的研究方法 基因组中某特定基因的开放或关闭状态，在不同细胞中差异很大某些基因在所有类型细胞中始终开放，称为看家基因；某些基因在某些类型细胞中始终关闭而在其他类型细胞中却始终表达，称为奢侈基因；另一些基因在一定类型细胞中只有一定的分化阶段才开放表达，称为分化特异性基因观察不同状态下某些特定基因开放的状态，已有一些行之有效的方法 1.DNase I超敏感分析法 转录活跃的基因常位于染色体结构松驰的区域，结构紧密的异染色区域中的基因一般是关闭的，异染色质对各种形式的降解作用有较强的抵抗力。

DNase I超敏感分析法(DNase I hype rsensitive assay)的原理为：用DNase I处理提取的细胞核，在适当时间后终止反应，以某种DNA内切酶处理DNase I降解产物以获得合适大小的片段，产物经凝胶电泳分离，以所分析基因的某一片段为探针作Southern杂交，放射自显影，以条带的位置判断所分析基因受降解的程度，从而推测该基因的关闭或开放状态 2.DNA的甲基化分析 甲基化DNA易形成异染色质使基因处于封闭状态，还可以直接抑制DNA的转录活性对DNA进行甲基化分析的方法很多，其中一种最为简单而行之有效的方法，是利用识别相同序列但具不同酶切位点的限制性内切酶同裂酶对甲基化的不同敏感特性，来观察所分析基因序列中特定核苷酸上的甲基化状态选用成对的同裂酶(如对5mC敏感及不敏感的酶)，分别处理样品DNA，同时进行电泳分离，Southern吸印，杂交，放射自显影，最后根据酶切片段在两种处理中的相对长度，判断甲基化状态值得注意的一点是，在大肠肝菌中扩增的基因片段，会发生脱甲基化作用，因此进行甲基化分析，必须用基因组DNA 3.细胞核转录状态分析 将待分析基因片段结合于硝酸纤维素膜上，而在待分析细胞完整细胞核中加入同位素标记的尿苷三磷酸，使转录反应在体外继续进行，由此获得标记了同位素的转录总RNA，使其与结合于硝酸纤维素膜上的基因片段进行杂交，由此推断待分析基因在所分析细胞中的开放状态。

由于所用RNA是完整细胞核在生活状态下的转录产物，因此称作细胞核转录状态分析 4.差异显示 如果两种细胞所表达的大部分基因都相同，而只有少数基因不同，就可以通过分子杂交使表达相同的基因形成双链，差异性表达的基因保持单链，以显示表达的差异具体的做法可大致概括为：以其中一种细胞的mRNA为模板合成第一链cDNA，再以此与另一种细胞的mRNA作退火反应，那些共同表达的基因，因其cDNA及mRNA序列互补而相互结合形成双链，而那些特异性表达的基因cDNA因无互补序列而保持单链状态，利用多种手段可以将双链核酸，单链cDNA及mRNA相分离，从而分别获得两种细胞特异性表达基因所对应的cDNA或mRNA以此为模板所最终建立起来的基因文库称差示文库(differential library)，又叫扣除文库(substracted library)近年兴起的基因芯片，用于基因表达的差异显示效率很高，正在成为差异显示的主要方法 二、顺式作用元件与反式作用因子的分析方法 基因组中的调控区可通过自身的结构特点或改变调控对象的结构，控制调控对象的转录活性，称作顺式作用元件，染色体外的调控因子(主要是蛋白质)通过与顺式作用元件的相互作用调控基因的表达，称反式作用因子，分析顺式作用元件和反式作用因子的方法主要有：1.体外转录 基本方法为：制备欲分析基因的DNA片段作为体外转录的模板，提取肝细胞核内物质作为体外转录体系，提供同位素标记的UTP以反映转录产物RNA的数量，然后经电泳分离、放射自显影观察转录产物数量，并以此推测所设定转录条件及体系中某些特定成分(即反式作用因子) 对该基因转录的调控作用及调控方式，也可研究模板序列中某些特异性的非编码区(即顺式作用元件)对基因表达的调控作用。

2.氯霉素乙酰转移酶分析 为了比较顺式作用元件的效率可以将不同的顺式作用元件插入同一种基因的特定位点，用该基因的表达效率显示顺式作用元件的效率差异被选定的基因称作报道基因，该基因的表达产物应易检测，且不受细胞中常见成分的干扰，目前常用的有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因和β-半乳糖酶基因，后者常用作解释前者产物活性的内标记 CAT酶的表达产物可使氯霉素乙酰化为1，3-二乙酰氯霉素及中间产物1-乙酰氯霉素，反应中用14C氯霉素或14C乙酰辅酶A对产物进行同位素标记，反应后产物可用薄层硅胶层析分离，放射自显影定量实验中所需的pSVoCAT质粒含有由SV40启动子启动的CAT基因，实验时可用EcoRI及HindⅢ切除pSVoCAT中的SV40启动子，再插入欲观察的启动子，将之导入哺乳动物细胞中进行瞬时表达(还可同时导入β-半乳糖苷酶基因作CAT酶分析的内标)，随后提取全细胞蛋白成分，与氯霉素和乙酰CoA保温，分析乙酰化氯霉素的量，其含量较高，说明CAT酶的活力较高，启动子的活力较强 近年来，普遍使用绿色荧光蛋白作报告基因绿色荧光蛋白（green flourescent pyotein,GFP)为报告基因 Per基因被置于GFP的上游，Per基因编码的蛋白质与果蝇的昼夜节律调节有关，图中所示果蝇头部的绿色荧光分散存在，并随昼夜节律变化，说明单个细胞有自己独立的生物钟。

3.凝胶滞留法 凝胶滞留法(gel retardation assay)又称迁移改变法(mobility shift assay)，是利用DNA与蛋白结合以后，在电泳中的迁移率减慢来观察DNA序列与蛋白质特异性结合的情况，可检测出10-15mol的DNA结合蛋白4.滤膜结合法 硝酸纤维素滤膜结合蛋白质，而不能结合双链DNA，使DNA-蛋白质混合体系滤过硝酸纤维素膜，洗脱未结合蛋白质的双链DNA片段，而结合了蛋白质的DNA片段被硝酸纤维素结合而留在膜上，用洗脱液将结合在膜上的DNA片段及对应的蛋白质洗脱下来就可进行一系列进一步的研究 这种方法称作滤膜结合法(filter binding assay)此法简单，快速，但灵敏度与精确度不高 5.Southwestern印迹法 将核蛋白提取物电泳后转移至硝酸纤维素膜上，然后与同位素标记的特异性DNA片段杂交如果在核提取物中，含有该DNA片段特异的结合蛋白，在放射自显影膜上就会出现条带，而且根据条带的位置还可确定此种结合蛋白的Mr此法结合了Western印迹及Southern印迹两种技术，因此称作Southwestern印迹法。

6.足纹法 DNA序列一旦结合了某种蛋白，便会排斥其他任何因子的进一步结合，抵抗核酸酶的降解，在酶解片断的高分辨率凝胶电泳中便会出现一空白区域，形似足迹，故称作足纹法(foot-printing)酶解时多用DNaseI无识别特异性地切割核苷酸序列，此法的优点是操作简单，足纹边界清晰；缺点是酶分子本身过大，使得足纹往往大于实际结合区域 7.蛋白-核酸紫外交联法 在Southwestern印迹法中，核蛋白提取物先电泳分离，再由标记的核酸片段对其进行杂交缺点是蛋白在与核酸片段结合前，已经在电泳过程中变性，影响核酸片段与蛋白结合的特异性结合理想的实验方法应该是使蛋白质与核酸先行结合， 再做电泳分离鉴定这就需要加强蛋白与核酸片段之间的连接作用，以使两者在随后的电泳过程中不致分离这一点可由紫外线照射来实现，相应的方法即称蛋白-核酸紫外交联法(UV-cross linking)紫外线照射使核酸嘧啶碱基与蛋白多种氨基酸残基之间形成共价连接，若用溴脱氧尿嘧啶取代正常的胸腺嘧啶可使结合物的稳定性增强经结合后，核酸上携带的标记转移到所结合的蛋白上，通过随后的蛋白电泳可以分析蛋白质的Mr。

8.DNA结合蛋白的分离纯化技术 由于DNA结合蛋白含量甚微，因此分离纯化工作相当困难，在目前常用的方法中，亲和层析较为理想常用方法是：在特异性DNA序列的末端标记生物素，使其与蛋白混合物反应，加入对生物素有亲和力的链亲和素，混合物共同上生物素纤维素柱，链亲和素具有4个与生物素结合的位点，因此以它为中介，将特异性DNA片段挂在了纤维素柱上，洗脱杂蛋白后，经高盐淋洗可将DNA结合蛋白洗脱下来9.DNA结合蛋白的cDNA克隆筛选 DNA结合蛋白量少而类多，上述亲和分离法实属窘迫的下策构建以λgt11为载体的基因表达文库，在诱导条件下各克隆表达外源基因与β-半乳糖苷酶基因的融合蛋白，以硝酸纤维素膜结合各克隆的表达产物，同位素标记的DNA片段与硝酸纤维素膜上结合的蛋白质作杂交反应，经放射自显影，可以高效率地挑选出含特异性编码序列的克隆  10.酵母双杂交法 双杂交系统确定蛋白质-蛋白质相互作用，将目标蛋白Y与TA融合表达，若Y与X可以相互作用，则DB和TA靠近，可以启动报告基因的表达。