[实验三]学习细菌培养的基本技术.doc

[实验三] 学习细菌培养的基本技术教学目标 1．知识方面 (1)通过本实验使学生了解微生物实验中无菌操作的方法及重要性；学习细菌培养的基础知识；加深对微生物的营养、代谢和影响生长的环境因素等知识的理解 (2)掌握培养基的制备、消毒灭菌及接种培养等基本操作方法，理解其原理 2．态度观念方面 培养严谨、求实的科学态度；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风及安全意识；提高学生的科学素质 3．能力方面 (1)培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力 (2)通过分组实验，统筹分配，培养学生动手操作能力和创新、应变能力重点、难点分析重点是了解微生物实验的一些最基本操作技术及其原理难点是根据本校条件如何保证实验的有序、有效地进行教学模式以课堂实验为主，课内外想相结合的教学，属于半独立性质及独立性质的实验教学手段学生分组实验、录像、投影仪课时安排大纲要求4课时针对高三年级的特点，建议老师们利用机动课时，最好安排连堂的两节课完成此实验设计思路教学过程一、课前准备1． 实验室 做好卫生，物品摆放有序，悬挂“微生物实验须知”在每次实验前，实验台、地面用3％的来苏水(或石碳酸)消毒，有条件的提前用紫外灯照射半小时。

接种箱在使用前用紫外灯照射半小时和熏蒸法半小时(高锰酸钾+甲醛)消毒在消毒过程中要严格监管，注意安全，尤其是紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直视紫外线，照射期间，室内不能有人或其他动物、植物 2．实验材料 (1)菌种 选择：菌种选择的原则是安全无毒、容易获得教材中所提供的金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌中的大部分是有毒的，不宜采用经反复筛选，我们选择了枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis) 制备和保存：可以向各级菌种站、大专院校索取或购买若五条件，也可以自己分离培养，方法如下： 取田园土10g加蒸馏水90mL制成土壤悬液，可再制成10-3、10—2、10—1各种稀释的土壤溶液，用涂布法在牛肉膏蛋白胨平板上培养，温度32℃培养38—48h后(适于芽孢生长)选择菌落乳白色，大小适中的镜检，可用结晶紫染色镜下菌体呈杆状，芽孢位于菌体中间或靠尖端．大小与菌体相当的即为所需菌种——枯草芽孢杆菌 无菌操作条件下将菌种转接到斜面培养基上，扩大培养，按实验班实际分组数，平均两组一支的数量进行准备如需保存一段时间，可待菌体充分生长后，将棉塞部分用油纸包扎好，置于冰箱内冷藏保存(4℃一6℃)，最好每月移种一次。

(2)药品 按课本要求准备，可从化学试剂或药品公司购买如五条件，牛肉膏也可自制，方法如下(以配制l 000mL培养基为例)：瘦牛肉(去筋去油)500g，切成小丁，加入1 000mL蒸馏水，煮熟(牛肉熟、凝集成块)过滤，补充蒸馏水至1 000mL如果实验室为学生配制，可直接从市场购买“营养琼脂”按说明调配 3．实验用具 (1)接种工具 可将电炉丝拉直，缠绕在玻璃棒或金属棒上制成；也可制成一次性接种针，用中号毛衣针从中间截断为二，打磨尖端使其不尖锐，以报纸扎好，注意大小头，每包10—12支，与培养基一起高压蒸汽灭菌这种接种工具的优点，首先是操作简单，不用灼烧灭菌；其次是容易控制，操作起来灵活方便，在接种划线时不会划破培养基；它也适用于有超净工作台的实验室(因为工作台抽风的过程常使酒精灯火焰不稳定)此外，这种接种工具经济易得，灭菌后还可反复使用 (2)灭菌设备 首选高压灭菌锅当实验室没有此设备时，可选择使用大的蒸笼，在这种情况下，蒸汽的压力不超过大气压，温度不超过100℃我们采用常压间歇灭菌法，即把培养基或其他灭菌物放在蒸笼内，每天蒸煮一次，每次30min，连续蒸煮3d。

在每两次蒸煮之间，将培养基或灭菌物放在28～30℃的条件下培养24 h，芽孢萌发成为营养体，在第二次蒸煮时又可被杀死，极少数在第一次培养中就形成的芽孢在第二次培养时萌发为营养体，在第三次蒸煮时也被杀死经过三次蒸煮，培养两次，基本上达到完全灭菌 (3)培养设备 首选恒温箱经实验，对于枯草芽孢杆菌，发育良好的温度为3212培养24～48 h若没有恒温箱也可室内培养，若室内温度稍低，则应延长培养时间 4．组成实验筹备小组为保证实验的顺利进行，可在课前组成实验筹备小组(可以自愿报名或由1～2个实验小组组成)这样一方面是让学生了解课前的准备工作，理解微生物实验的具体要求和特殊性，对其他学生有指导作用；另一方面，通过小组的课前实际操作，便于掌握整个实验不同步骤所需的大约时间；同时，也可为上课准备材料 (1) 制备斜面培养基(供接种用)2) 实验环境和人体表面微生物的检查(见下表) 实验器材 操作方法 样品来源 培养条件 实验结果牛肉膏蛋白胨 琼脂平板 酒精灯 接种针严格无菌操作方法 空气 实验台 手 头发口腔(咳嗽)37℃，24—48小时 菌落计数， 菌落类型描述 注意： ● 在取样时尽量安排对比实验：如“实验室空气”，一组选择实验室上课时采集，一组可选择放在无人走动的实验室；再比如“手”可设置二到三组：(A)未做任何处理；(n)肥皂清洗后；(C)用酒精擦拭后。

● 指导学生动手操作以前，在平板皿底用记号笔写上班级、姓名、日期、样品来源，字尽量小些，靠皿底一侧，不要写在中间，以免影响观察结果5．布置好预习由于本次实验内容多、时间长，建议教师安排课前预习动员，可以让学生根据本班实际情况，结合实验内容和实验时间(每步骤的大约时间由教师提供)，对实验的步骤安排进行统筹，对于科学合理的计划予以采纳这样，让学生参与实验课的设计·，既激发了学习兴趣，调动学习主动性，又达到了充分预习的目的，使学生在实验前了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚 二、实验过程 导入：常言道“眼见为实”，而小小的微生物我们肉眼看不到它，它却无缝不钻，无孔不入先请实验筹备小组的同学为我们讲述一下他们的实验：“环境中的微生物”由学生代表介绍实验的步骤、方法，通过照片和实物运用对比的方法，显示菌落的数量及特征经过介绍，使学生在第一次进入微生物学实验室时，建立起“微生物无所不在”的概念，这样才能真正体会到无菌技术和环境卫生的必要性然后教师按照实验顺序顺序讲解要点和注意事项： ●在实验中就如何提高实验速度，克服操作中的困难等问题，应该积极思考，改进方案大胆创新 ●对消耗材料和药品要力求节约，用毕仍放回原处。

在此基础上，学生按照分发的实验指导材料开始分组实验，教师巡回指导1． 培养基的配制 在配制过程中会遇到很多问题：如怎样称量牛肉膏?琼脂怎样溶化得快而充分?可以改变培养基的凝结速度吗?等等可以先在学生中征求方案，学生们边实践边总结交流 在实验中发现，配方中适当增加琼脂的含量可提高培养基的凝结速度，如室温较高可加入2．5～3g琼脂另外，在程序上应先盛量100mi蒸馏水，加人称量好的琼脂浸泡(泡软后再加热容易溶化)后，再进行其他工作 牛肉膏的称量可利用硫酸纸和玻璃棒；蛋白胨容易吸潮，所以称量动作要快 在加热时，培养基沸腾后要不断搅拌，防止溢出，充分溶化后补加蒸馏水至lOOmL(可供制8～12个斜面培养基) 从加热到完全融化约需10min左右，这时可以让学生根据实验指导资料制作棉塞(见教参)，同时讨论为什么制作的棉塞不能太紧，也不能太松?(经过实验，总结出棉塞容易拔下，并发出噗的一声轻响为合格) 在培养基的分装过程中，可以让学生先用水进行练习，摸索出如何把握量的问题，滴管伸人试管的深度等；并熟练快进快出另外关于分装装置，可以简化(见图1)，这样既方便操作，又减轻了实验室的工作量。

最后，小组同学分工合作完成加棉塞和包扎，注明培养基名称，配制的日期和制作者姓名，并做好自检和互检工作，准备无误后，等待灭菌 2．灭菌 由各实验小组把本组的灭菌物品放人高压蒸汽灭菌锅内，由实验室教师负责灭菌(在准备室内)问：高压锅是怎样工作的?在学生回答的基础上总结出高压蒸汽灭菌的原理教师给出资料(表1、表2)：表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 表2 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较 分组讨论：同一温度下，湿热灭菌优于干热灭菌的原因?如果高温水蒸汽又高压，灭菌效果会怎样? 请实验筹备小组的同学结合自身实践，讲解高压蒸汽灭菌的方法 主要内容如下： ●用实物和剖面图介绍高压蒸汽灭菌锅的基本构造 ●具体操作步骤(录像、照片等)● 注意细节：如高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?在使用时怎样杜绝一切不安全的因素?(分析讨论)第二课时(课前进行实验台面、地面消毒)3、接种利用课前实验筹备小组制备的斜面培养基进行接种操作由教师利用录像(五条件的可用图示和演示操作结合)分步讲解在无菌操作的条件下接种的步骤和要点 强调： ●实验过程中，应保持室内安静，勿高声谈话和随意走动。

●实验过程中要小心仔细，注意酒精灯的使用，保证安全全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到有盛菌试管不慎打破，皮肤破伤等意外情况发生，应立即报告指导教师处置 ●对用过的棉签、接种针(竹制)、培养物等均放在指定的容器内 在学生分组实验时，应为每个实验组准备一套练习用试管，使学生能反复操作，熟练手部动作菌种试管和接种的斜面试管都应放在试管架上 另外，应准备接种操作程序图(见课本，也可用投影仪打在大屏幕上)：接种环(金属制)的火焰灭菌步骤(见图2)、斜面划线图示(见图3)，进行指导 如有条件，也可安排几组同学在接种箱(或超净工作台)进行接种一方面使学生了解微生物学实验的接种器具，另一方面可对实验结果进行比较 接种完毕后，以组为单位，为斜面试管挂标签，并填写所接菌种名称、接种日期、接种者姓名，并放在指定的恒温箱内培养 以组为单位完成整理工作 4．搁置斜面 培养基灭菌20～30min，保压时间结束后，应停止加热，使其自然冷却此时切勿急于打开放气阀因为压力骤然降低，会导致培养基剧烈沸腾而冲掉或污染棉塞待压力接近零时，再打开放气阀 排气完毕后，即可扭松盖上螺栓，使锅盖松动，等待15～20心n后,可以取出已灭菌物品（注意：此步可以由实验教师完成，如需要学生操作应注意安全，不要烫伤，准备手套。

摆放斜面之前，应给学生充分时间讨论、实验，选取合适的摆放材料，如书本、木块等，使斜面的高处不超过试管的1／2(如图4)应趁热摆放，不能随意晃动，争取一次成功为下面实验班的接种操作提供斜面培养基) 5．培养观察： 培养条件：恒温箱32℃，24～48h 可以以实验小组为单位，设计观察记录表(见表3)，利用课余时间做好观察记录和结果分析 培养特征 菌种 培养时间 备注 生长程度 菌苔形状菌苔隆起形状 表面光泽 透明程度 颜色 质地 其他表3 斜面培养特征观察记录表。