16S-rRNA基因高通量测序分析-牛粪发酵相关细菌多样性.pdf

报报 告告 人人：王二耀：王二耀 单单 位：河南农业科学院畜牧兽医研究所位：河南农业科学院畜牧兽医研究所 时时 间：间：20162016年年1010月月2222日日 16S 16S rRNArRNA基因高通量测序分析基因高通量测序分析 牛粪发酵相关细菌多样性牛粪发酵相关细菌多样性 中原经济区农业循环技术集成与示范 1 目目 录录 研究背景研究背景 牛粪发酵过程中细菌多样性分析牛粪发酵过程中细菌多样性分析 启示与建议启示与建议 2 研究背景研究背景 我国肉牛业生产方式的变迁我国肉牛业生产方式的变迁 分散式饲养分散式饲养 集约化集约化饲养饲养 3 养殖粪污成为行业发展限制性因素养殖粪污成为行业发展限制性因素  每头肉牛平均每天产生 30 Kg的粪便，每年牛约产生10吨的粪便，按1000头规模的牛场计算，全年粪便总量可达到1万吨  养殖粪污正成为环境污染的来源，10 万头牛对环境的污染相当于100 万人口的污染程度  粪污处理设施是新建牛场时环评的重点考核内容  粪污处理增加了养牛业的成本 4 肉牛 养殖 养殖 粪污 生物 肥料 种植 环 境 污 染 养殖粪污养殖粪污资源化资源化处理处理是个双赢的方案是个双赢的方案 5 养殖粪污的处理方式养殖粪污的处理方式  直接还田：污染环境  腐熟堆肥处理：周期长，效果不稳定  生产沼气：沼液处理难度更大  无害化处理：成本过高 • 固液分离 • 废水回收 • 生物发酵 • … 成本与效果 是选择粪污处理方式的关键因素 6 微生物是堆肥的生物基础微生物是堆肥的生物基础  研究堆肥过程中的细菌多样性变化，对于理解牛粪堆肥过程、提高堆肥效果，乃至开发新型堆肥益生菌剂都具有重要的意义。

 之前关于堆肥过程中细菌种群的研究，大多采用实验室培养、分离、鉴定的手段，但受培养方式的限制，仅能对粪肥中有限的细菌类别进行分析  16S rRNA基因可以做作为揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定研究的指标[5]16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA gene amplicon sequencing）能够对样品中的全部细菌进行种类和丰度鉴定，从而给环境细菌的研究提供了新的思路 7 牛粪发酵过程中细菌多样性分析牛粪发酵过程中细菌多样性分析 研究目标研究目标  利用16S rRNA基因扩增子测序技术分析牛粪堆肥过程中细菌的多样性变化规律 采样地点采样地点  河南省新乡市河南农科牛业科技有限公司 8 收集牛粪 自然发酵 添加益生菌剂发酵 技术路线技术路线 样品采集 测序分析 样品采集： 1、自然发酵0月（m0） 2、自然发酵1月（m1） 3、自然发酵6月（m6） 4、益生菌剂发酵3月（mf） 样品DNA提取 PCR扩增 产物纯化 文库制备 测序分析 数据分析 • 16S rRNA基因的V3区域 • 引物添加barcodes 9 测序分析技术路线测序分析技术路线 10 ＤＮＡ提取与ＰＣＲ扩增ＤＮＡ提取与ＰＣＲ扩增 牛粪基因组DNA提取结果 PCR扩增结果 不同样品使用了不同的barcode组合 11 测序数据与质控测序数据与质控 Sample Name Raw PE(#) Qualified (#) Base(nt) AvgLen( nt) Q30 GC% Effective % m0.1 61,915 58,432 7,451,739 141 99.76 50.34 85.37 m0.2 45,293 42,130 5,589,009 145 99.75 49.75 85.17 m0.3 69,598 65,086 8,364,705 144 99.77 49.85 83.69 m1.1 42,503 39,632 5,072,301 145 99.75 52.98 82.17 m1.2 73,307 68,375 9,290,791 148 99.76 49.62 85.4 m1.3 56,576 51,829 6,831,263 148 99.75 50.61 81.75 m6.1 61,166 56,943 7,269,522 144 99.75 50.29 82.52 m6.2 37,270 34,249 4,577,614 148 99.75 50.54 82.79 m6.3 68,984 64,052 9,058,358 152 99.74 50.1 86.16 mf.1 72,934 68,948 9,217,002 144 99.64 53.46 87.58 mf.2 71,698 65,659 7,970,675 144 99.49 53.52 77 mf.3 74,473 70,015 9,263,208 146 99.64 53.42 85.13 Average 61,310 57,113 7,496,34 9 146 99.71 51 84 每个样品的平均reads数为61310，平均长度为146nt，Q30为99.71。

12 OTUOTU分析分析  为了研究样品的物种组成多样性，对所有样品的有效Tags进行聚类 ， 以 97% 的 一 致 性 将 序 列 聚 类 成 为 OTUs （ operational taxonomic units），其中自然发酵组（m0、m1、m6）和添加益生菌剂发酵组（mf）观测到的平均OTU数量分别为1612、1598、1428和1552 分组分组 Groups 样品名称样品名称 Sample names Tag数量数量 Tag numbers OTU数量数量 OUT numbers 平均平均OTU数量数量 OUT means m0 m0.1/m0.2/m0.3 47549/35959/51919 1590/1561/1686 1612 m1 m1.1/ m1.2/ m1.3 31354/58275/43088 1447/1689/1657 1598 m6 m6.1/ m6.2/ m6.3 46434/28949/57909 1694/1333/1258 1428 mf mf.1/ mf.2/ mf.3 55721/48540/53190 1532/1522/1601 1552 13 物种注释物种注释  对OTUs的代表序列进行物种注释，各个样品中在门（Phylum）水平上丰度排名前10的物种见图。

14 15 其中厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门的细菌数量总和占到了各 组样品中细菌总数的70%以上 样品样品复杂度分析复杂度分析（（AlphaAlpha DiversityDiversity））  通过样本的复杂度分析可以反映样品内的细菌群落的丰富度和多样性 物种累积曲线（species accumulation curves） 16 分组分组 Groups 样品名称样品名称 (Sample names) 观测物种数观测物种数 (observed_species) Shannon指数指数(Shannon index) Chao1 丰富度估计量丰富度估计量 (Chao1 richness estimator) 测序测序 深度深度 指数指数 (Good ’s covera ge) m0 m0.1 1421 8.363 1683.408 0.989 m0.2 1392 8.074 1532.502 0.992 m0.3 1508 8.417 1783.113 0.988 平均 1440 8.285 1666.341 0.990 m1 m1.1 1269 7.441 1399.455 0.992 m1.2 1388 6.683 1563.957 0.99 m1.3 1434 7.771 1563.927 0.99 平均 1364 7.298 1509.113 0.991 m6 m6.1 1488 8.256 1748.015 0.989 m6.2 1333 7.755 1605.201 0.987 m6.3 897 5.603 1086.302 0.991 平均 1239 7.205 1479.839 0.989 mf mf.1 1333 6.974 1668.905 0.987 mf.2 1314 7.768 1610.227 0.988 mf.3 1412 7.91 1654.758 0.988 平均 1353 7.551 1644.630 0.988 注：Shannon指数：用来计算群落多样性，Shannon指数越大，说明群落多样性越高。

Chao1 丰 富度估计量：用来计算群落丰度，Chao1值越大代表物种总数越多测序深度指数：用来计算 测序的覆盖度，其数值越高，则覆盖度越好 各个样品的细菌群落多样性 17 其中m0、m1、m6和mf组观测到的平均物种数分别为1440、1364、1239和1353但统计表明，所有各组间的观测物种数、Shannon指数和Chao1丰富度估计量均无显著差异（P > 0.05） 所有个体的测序深度指数都在0.98以上，说明测序结果能够展示样品中绝大部分的信息 18 多样品多样品比较分析比较分析（（BetaBeta DiversityDiversity））  Beta Diversity是对不同样品的微生物群落构成进行比较分析首先根据所有样品的物种注释结果和OTUs的丰度信息，将相同分类的OTUs信息合并处理得到物种丰度信息表,并利用OTUs之间的系统发生关系，进一步计算Unifrac距离 19 20 21 主成分分析 对各组样品的细菌群落进行了主成分分析（PCA，principal component analysis） 其中m1和m6的群落组成最相近，通过PCA分析难以区分；m0与m1、m6的组成 较为接近，mf的群落组成差异最大。

22 聚类分析 为了进一步研究不同样品间的相似性，对样品进行了聚类分析并构建了样品的聚类树 与PCA的分析结果类似，mf被单独聚为一支，m0、m1和m6被聚为一大支 组间物种差异分析组间物种差异分析 分组分组 (Groups) 厚壁菌门厚壁菌门 Firmicutes 变变形形菌菌门门 Proteobacteria 平均值 Mean 标准差 SD P值 P value 平均值 Mean 标准差 SD P值 P value m0 0.271 0.046 0.011 0.133 0.071 0.026 m1 0.429 0.093 0.020 0.096 0.025 0.004 m6 0.313 0.089 0.026 0.247 0.058 0.021 mf 0.035 0.008 - 0.438 0.010 - 使用T-test分别分析了门水平上mf与m0、m1、m6的差异物种，结果见表 mf组与m0、m1、m6组相比具有较多的变形菌门细菌（P < 0.05）和较少的 厚壁菌门细菌（P < 0.05） 23 结论结论  新鲜牛粪、自然发酵1个月、自然发酵6个月的牛粪中细菌种群并没有明显的变化规律，说明自然发酵过程主要依赖于新鲜牛粪中携带的细菌种群；  添加益生菌发酵后，细菌种群明显不同于自然发酵过程中的细菌种群，其中变形菌门（Proteobacteria）细菌显著增加，而厚壁菌门（Firmicutes）细菌显著减少，说明益生菌剂能够显著改变堆肥过程中的细菌种群。

24 启示与建议启示与建议 在循环农业在循环农业中需要维持微生物的多样性中需要维持微生物的多样性  各个发酵时期的样品都有着丰富的生物多样性，且组间无显著差异，说明发酵过程并未降低粪肥中的细菌多样性，同时也进一步证明细菌是牛粪发酵过程的生。