细菌α淀粉酶产生菌种筛选.ppt

细菌细菌α-淀粉酶产生菌淀粉酶产生菌种筛选种筛选一．一．实验目的目的1．掌握从．掌握从环境中采集境中采集样品并从中分品并从中分离离纯化某种微生物的完整操作步化某种微生物的完整操作步骤2．巩固所学的微生物学．巩固所学的微生物学实验技技术二二. 实验原理原理 α-淀粉淀粉酶是一种液化型淀粉是一种液化型淀粉酶，它的，它的产生菌芽生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉在含有淀粉类物物质的土壤等的土壤等样品中从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定种分离和性能测定 1、采、采样：即采集含菌的：即采集含菌的样品品1）研究所）研究所筛选的微生物得可能分布区域的微生物得可能分布区域2）土壤是微生物的大本）土壤是微生物的大本营，所以一般采集土，所以一般采集土样3）土壤中，数量上）土壤中，数量上细菌菌>放放线菌菌>霉菌霉菌>酵母菌4) 不同区域的土壤含有相不同区域的土壤含有相应的的优势微生物例如微生物例如树林腐土和朽木中林腐土和朽木中纤维素分解菌素分解菌较多；面粉厂附多；面粉厂附近、栽种淀粉近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌作物土壤中淀粉的分解菌较多；多；果果实、、树叶表面酵母菌叶表面酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸多；蔬菜、牛奶中乳酸菌菌较多；油田、多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。

多等2、增殖培养（又称富集培养）、增殖培养（又称富集培养） 增殖培养就是在所采集的含菌增殖培养就是在所采集的含菌样品中加品中加入某些物入某些物质，并，并创造一些有利于待分离微造一些有利于待分离微生物生生物生长的其他条件，使能分解利用的其他条件，使能分解利用这类物物质的微生物大量繁殖，从而便于采用稀的微生物大量繁殖，从而便于采用稀释分离法分离到分离法分离到这类微生物因此，增殖微生物因此，增殖培养事培养事实上是上是选择性培养基的一种性培养基的一种实际应用3、、纯种分离种分离 在生在生产实践中，一般都践中，一般都应用用纯种微生种微生物物进行生行生产纯种分离的方法很多，主要种分离的方法很多，主要有：平板划有：平板划线分离法、稀分离法、稀释分离法、分离法、单孢子或子或单细胞分离法、菌胞分离法、菌丝尖端切割法等尖端切割法等最常用的分离方法是稀释分离法最常用的分离方法是稀释分离法4、性能、性能测定定 分离得到分离得到纯种只是种只是选种工作的第一种工作的第一步所分离的步所分离的纯种是否具有生种是否具有生产上要求上要求的的优良性能，良性能，还必必须进行性能行性能测定，根定，根据性能高低据性能高低进行取舍。

行取舍性能性能测定的方法定的方法1）初）初筛：：一般在培养皿上根据一般在培养皿上根据选择性培养基性培养基的原理的原理进行 例如要例如要筛选淀粉淀粉酶产生菌，可以在稀生菌，可以在稀释分离分离时使用使用选择培养基培养基——含淀粉的培养基，含淀粉的培养基，经培养后通培养后通过测定透明圈与菌落直径的比定透明圈与菌落直径的比值来衡量淀粉来衡量淀粉酶活力的高低活力的高低 2）复）复筛：：在初在初筛的基的基础上做比上做比较精精细的的测定一般是将微生物培养在三角瓶中作定一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养或固体培养，瓶培养或固体培养，对培养物培养物进行分析行分析酶活性活性 测定根据酶活性的大小，活性的大小，进一步一步对所分离的菌种所分离的菌种进行挑行挑选三．三．实验材料材料1、材料：、材料：小小铁铲和无菌和无菌纸或袋无菌水或袋无菌水三角瓶（三角瓶（300mL的瓶装水至的瓶装水至99mL，内有玻，内有玻璃珠若干）；无菌吸管（璃珠若干）；无菌吸管（1mL，，5 mL等）；等）；无菌水无菌水试管（每支水）；无菌培养皿；管（每支水）；无菌培养皿； 2、培养基、培养基1）分离培养基（）分离培养基（w/v）：）：蛋白蛋白胨 1%；；NaCl 0.5%；牛肉膏；牛肉膏 0.5%；可溶性淀粉；可溶性淀粉 0.2%；；琼脂脂1.5%；；水定容。

注：；；水定容注：先将可溶性淀粉加少量蒸先将可溶性淀粉加少量蒸馏水水调成糊状，再加到溶化成糊状，再加到溶化好的培养基中，好的培养基中，调匀 2）肉膏蛋白）肉膏蛋白胨培养基（培养基（w/v））：肉膏蛋白：肉膏蛋白胨培养基：牛培养基：牛肉膏肉膏0.3%，蛋白，蛋白胨1%，，NaCl 0.5%，，琼脂脂3）麸曲培养基：）麸曲培养基：麸皮麸皮7克；克； 玉米面玉米面 1克；克； 克克 (4%(NH4)2SO4加加1mL)；； NaOH克克(8%NaOH加加lmL)；水；水10mL，混合均匀，装入，混合均匀，装入250-300mL三角瓶中，三角瓶中，15磅磅灭菌菌30分分钟3.试剂：：1））Lugol氏碘液：氏碘液：碘碘1克，碘化克，碘化钾2克，水克，水300毫升 配制配制时先将碘化先将碘化钾溶于溶于5-10毫升水中，再加入碘，溶解后毫升水中，再加入碘，溶解后定容2）碘原液：）碘原液： 碘碘 2.2%；； 碘化碘化钾 4.4%；； 加水定容加水定容3）比色稀碘液：）比色稀碘液：碘原液碘原液2mL，加碘化，加碘化钾20g，定容至，定容至500mL现配配现用4））0.2%可溶性淀粉液（可溶性淀粉液（w/v））：称取克可溶性淀粉，先：称取克可溶性淀粉，先以少以少许蒸蒸馏水混合，再徐徐水混合，再徐徐倾入煮沸蒸入煮沸蒸馏水中，水中，继续煮沸至透明煮沸至透明为止，冷却定容至止，冷却定容至100ml。

5）磷酸）磷酸氢二二钠--柠檬酸檬酸缓冲液：冲液：克，克，柠檬酸檬酸 克，加水定克，加水定容至容至250mL 四．四．实验方法方法 1、分离纯化、分离纯化①①采集样品采集样品②②样样品品稀稀释释：：在在无无菌菌纸纸上上称称取取样样品品1g，，放放入入100mL无无菌菌水水的的三三角角瓶瓶中中，，手手摇摇10分分钟钟80℃水水浴浴15分分钟钟，，冷冷却却用用1mL无无菌菌吸吸管管吸吸取取注注入入无无菌菌水水试试管管中中，，梯梯度度稀稀释至释至10-6 ③③稀稀释释分分离离：：用用稀稀释释样样品品的的同同支支吸吸管管分分别别依依次次从从10-4、、10-3、、10-2样样品品稀稀释释液液中中，，吸吸取取1mL，，注注入入无无菌菌培培养养皿皿中中，，然然后后倒倒入入灭灭菌菌并并融融化化冷冷至至50℃左左右右的的固固体体培培养养基基，，小心摇动冷凝后，倒置于小心摇动冷凝后，倒置于37℃温箱中培养温箱中培养24小时 ④④碘液碘液检查：培养：培养24小小时后，取出平板，无菌后，取出平板，无菌操作向皿中注入操作向皿中注入1滴滴Lugol氏碘液，因淀粉遇氏碘液，因淀粉遇碘碘变蓝色，如菌落周色，如菌落周围有无色圈，有无色圈，说明明该菌菌能分解淀粉。

能分解淀粉⑤⑤菌种菌种纯化：化：无菌操作从平板上无菌操作从平板上选取淀粉水解取淀粉水解圈直径与菌落直径之比圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种大的菌落，用接种环沾取少量培养物至斜面上，并沾取少量培养物至斜面上，并进行行2-3次划次划线分离，挑取分离，挑取单菌落至斜面上，培养后菌落至斜面上，培养后观察察菌苔生菌苔生长情况并情况并镜检验证为纯培养2、麸曲培养、麸曲培养 取取纯化菌落斜面中加入化菌落斜面中加入5mL无无菌水制成菌菌水制成菌悬液，取液，取1mL接种至麸接种至麸曲培养基中，曲培养基中，搅匀后，匀后，36-37℃培养培养24小小时 3、、酶活活测定定 ①①制制备酶液：液：在已成熟的夫曲三角瓶中，加水在已成熟的夫曲三角瓶中，加水100mL，，搅匀，置匀，置30℃水浴水浴30分分钟，用脱脂棉，用脱脂棉过滤，，滤液即液即细菌菌α-淀粉淀粉酶液 ②② 酶活活测定：定：在三角瓶中，加入在三角瓶中，加入0.2%可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液2mL，，缓冲液，在冲液，在60℃水浴中水浴中10分分钟平衡温度，加入平衡温度，加入3mL酶液，充分混匀，即刻液，充分混匀，即刻记时，定，定时取出一滴反取出一滴反应液液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐渐变为红棕色，即棕色，即为反反应终点，点，记录时间（（t），），单位位为分分钟。

③酶活力活力单位的位的计算算淀粉淀粉酶活力活力单位的定位的定义：：1克或克或1mL酶制制剂或或酶液于液于60℃，在，在1小小时内液化可溶性淀粉的克数内液化可溶性淀粉的克数 [克克/克克(或毫升或毫升)·小小时]淀粉淀粉酶活力活力单位位=（（60/t））×2×0.2%×f/3（（f/t）） 式中式中f是是酶的稀的稀释倍数 注意事注意事项：：①①淀粉液淀粉液应当天配制使用，不能久当天配制使用，不能久贮②②测定液化定液化时间应控制在控制在2~3分分钟内五．五．实验报告告 总结整个分离整个分离筛选过程，写出程，写出筛选结果并果并对筛选结果果进行分析六六. 实验时间安排安排周一：周一：配制培养基并配制培养基并灭菌、配制菌、配制试剂；稀；稀释分离，分离，37℃培养培养24h周二：周二：碘液碘液检查，挑取透明圈直径：菌落，挑取透明圈直径：菌落直径比直径比值大的大的单菌落，平板划菌落，平板划线，，37℃培养培养24h周三：周三：挑取挑取单菌落接斜面培养基菌落接斜面培养基周四：周四：接麸曲培养基，接麸曲培养基，37℃培养培养24h周五：周五：测定定酶活各各组任任务安排安排•一一组：：分离培养基分离培养基2000mL。

无菌水无菌水60支包扎1mL移移液管液管10支支•二二组：：肉膏蛋白肉膏蛋白胨培养基培养基 包扎1mL移液管移液管10支培养皿养皿30套•三三-五五组：每：每组各各6瓶，瓶，纱布塞培养皿布塞培养皿20套套•六六组：：1））Lugol氏碘液氏碘液300mL，分装，分装6个棕色滴瓶个棕色滴瓶 2）碘原液）碘原液100mL 3）比色稀碘液）比色稀碘液3000mL分装6个棕色个棕色试剂瓶 4）磷酸）磷酸氢二二钠--柠檬酸檬酸缓冲液冲液2000mL，分装，分装6个个试剂瓶。