荔枝多糖的分离纯化,化学结构.ppt

LOGO荔枝多糖的分离纯纯化，化学结结构及 其应应用研究进进展主讲讲人 李江明 指导导老师师 秦小明ContentsYour site hereCompany Logo荔枝简介荔枝多糖的化学结构及 其生理活性荔枝多糖的提取、分离纯化荔枝多糖的提取、分离纯化一、荔枝简简介Your site hereCompany Logo荔枝属无患子科常绿乔 木，是华南地区的主要 特色水果荔枝果肉色 泽鲜红 ，肉质洁白晶莹 ，汁多味美，营养丰富 ，深受大众喜爱，享有“ 中华之珍品、岭南果王” 的美誉据中医记载， 荔枝果肉有补脾、益肝 、养血、悦颜之功效荔枝果肉中含有大量的糖 、维生素C、磷、钙，以 及少量蛋白质、脂肪、铁 、维生素B等人体必需的 营养物质除这些主要 的营养成分外，荔枝果肉 中还含有具有很多生物活 性作用的多糖类物质荔枝荔枝 果皮果皮荔枝果皮中富含多种花色素类物质，这类成分以苷的形 式存在于荔枝果皮中花色苷类物质具有较多生理活性 功能，包括抗氧化及清除自由基、降低血清及肝脏中的 脂肪含量、抗变异及抗肿瘤，防止体内过氧化作用等 另外果皮中还存在一些具有很强抗氧化作用的酚酸、黄 酮类物质。

荔枝核荔枝核荔枝核种子中含有皂苷.12%，蒜质3.43%，还原糖9.74% ，淀粉及总糖12.5%此外还有脂肪酸、氨基酸、聚合 花色素成分此外还含有多元醇、酸性物质及少量的蛋 白质和矿物质等荔枝核中的多种幽醇及其营类、多元 醇均具有一定的降血脂作用荔枝Your site hereCompany Logo荔枝多糖的化学结结构及其生理活性vLCP为为一种不含单单糖、多酚和蛋白质质的非淀 粉类类多糖主要是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、核糖组组成的杂杂多糖其糖苷键连键连 接形式为为1一3、1一2和1一6，比例为为: 68.4 : 25.5 : 6.1Your site hereCompany Logo荔枝多糖生物活性抗肿瘤抗 病毒降血糖 降血脂抗药性溃疡抗衰老提高人体免疫 力抗炎症抗感染抗氧化与延 缓衰老作用研究表明：新鲜荔枝果肉及其粗多糖有清除活 性氧自由基及抑制肝线粒体脂质过氧化物LPO 的能力 LCP抗脂质过氧化作用其的抑制率与多糖呈正 相关关系，显示LCP在抗活性氧、抗衰方面具 有较强的作用采用荔枝种仁油饲喂老鼠，发现能显著提高大鼠血脂的HDL一C/TC比值，促进胆固醇代谢，这对预防心血管疾病非常有利。

据资料显示花色昔类物质具有降低血清及肝脏中脂肪含量的作用，而荔枝皮中富含多种花色昔类物质，因此，荔枝皮可能也具有很好的调血脂作用调血脂 作用采用反相被动血凝法和酶联免疫吸附分析法研究发现，荔枝核水提取物是乙型肝炎病毒表面抗原的高效抑制剂应用HBV—DNA斑点杂交法，证明荔枝核水提物 能完全抑制乙肝病毒的复制抑制乙型肝 炎病毒研究表明，荔枝核总皂苷提取物具有较强的降低糖尿病小鼠血糖功能，且其降血糖效果优于优降糖与黄连素降血糖 作用三、荔枝多糖提取、纯化原料处理 热水浸提离心 浓缩 除蛋白醇沉 抽 滤透析 洗涤 干燥荔枝粗多糖 分析测定荔枝多糖荔枝多糖 的提取的提取v（1）原料处处理称取一定量荔枝干果，根据设设 定好的料液比加入蒸馏馏水浸泡一段时间时间 ，待荔枝干果吸水膨胀胀，再用高速组织捣组织捣 碎机捣捣碎Your site hereCompany Logov（2）热热水浸提：在浸提前，先将捣捣碎的样样品在电电炉上缓缓缓缓 加热热至需要温度，再放进进水浴锅锅中进进行恒温浸提，到时间时间 后，取出冷却。

用双层纱层纱 布进进行过滤过滤 ，弃掉滤滤渣，得较较澄清的浸提液Your site hereCompany Logov（3）离心：浸提液用台式高速离心机进进行离心20min，速度 4500r/min，可除去残渣得到澄清度较较高 的浸提液，提高多糖提取率v（4）浓缩浓缩 ：将离心过滤过滤 的浸提液放进进 60~70℃的 水浴锅锅中进进行蒸发浓缩发浓缩 ，直至体积浓缩为积浓缩为 原来的 1/5Your site hereCompany Logov（5）除蛋白： 采用三氯氯乙酸法去蛋白，将浓缩浓缩 好的溶液倒入分液漏斗中，加入等量的 5％三氯氯乙酸 与正丁醇溶液进进行除蛋白，重复数次将收集的多糖 液再加入体积积等量的氯氯仿与正丁醇溶液（5:1）在分液 漏斗中脱蛋白，重复数次Your site hereCompany Logov（6）醇沉：大部分多糖在有机溶剂剂或高浓浓度的盐盐溶液中的溶解度极小，可用乙醇来沉淀将脱蛋白多糖液沿着玻璃棒缓缓缓缓 加 入到 95％的乙醇溶液中，放置 24h 以上将析出物反复溶解与醇析Your site hereCompany Logov（7）抽滤滤将已经过经过 醇沉的多糖液用抽滤滤装置 进进行抽滤滤，收集滤滤渣。

Your site hereCompany Logov（8）透析（去盐盐及小分子物质质）在滤滤渣中加适量蒸馏馏水溶解后灌入 透析袋中，离液面 2.3cm 处夹紧处夹紧 透析袋，置于一大烧烧杯中，注入蒸馏馏水至完全浸没透析后，每 8h 换换 1次水，重复 3～4 次Your site hereCompany Logov（9）洗涤涤干燥：将已透析的多糖溶液依次用无 水乙醇、丙酮酮、乙醚进醚进 行清洗，重复 3 次洗涤涤后湿 多糖在 60℃下真空干燥即得粗多糖Your site hereCompany Logo荔枝粗多糖的纯纯化v用于大分子多糖及多糖类类复合物的分离纯纯化方法很多，有分步沉淀法、金属络络合物法、离子交换换法、分子筛层筛层 析法、亲亲和层层析法、高压压液相层层析法等本实验实验 用柱层层析，有DEAE一纤维纤维 素柱层层析、SePhadex柱层层析Your site hereCompany Logo纯纯化工艺艺路线线Your site hereCompany Logo柱层层析原理v纤维纤维 素柱层层析用无水乙醇调调粗多糖溶液的酒精度达80%以上，使多糖全部沉淀于惰性多孔的纤维纤维 素柱上面，然后用由高到低的不同浓浓度乙醇洗脱，则则不同多糖就依次洗脱出来。

洗脱过过程中，各种多糖在柱上进进行无数次的溶解和沉淀过过程，最终终将各种多糖分离开来Your site hereCompany Logov凝胶柱层层析法根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼琼脂 糖凝胶，以及Sephacryl等，展层剂为层剂为 各种浓浓度的盐盐溶液及缓缓冲液，其离子强度不应应低于0.02 mol/LYour site hereCompany Logo荔枝粗多糖的纯纯化步骤骤v一、DEAE一52纤维纤维 素柱层层析纯纯化LCP1 DEAE-52的预处预处 理与纤维纤维 素层层析柱的制 备备……2 上样样在一般情况下，分析柱的上样样体积积不应应超过过柱 床体积积的10%，制备备柱的上样样体积积不超过过柱床 体积积的40%Your site hereCompany Logo加样样前，打开柱流出口，排除床表面缓缓冲液，关闭闭出口，用移液管加样样，使样样品沿柱内壁从床表面上数毫米处处流下， 随加随沿柱内壁转动转动 一周，然后移至中心，使样样品尽快分布于全表面;再打开出口，继续继续 加样样，待样样品全部进进入柱床内，可用少量起始缓缓冲液洗柱内壁和床表面，注意不要破坏床表面的平整。

Your site hereCompany Logov3 洗脱加样样后，然后分别别用含有0.lmol/L、0.5mol/L、1.0mol/L NaCl的Tris-HCl缓缓冲液进进行梯度洗脱控制流速0.4ml/min，每管4ml，以苯酚一硫酸法检测检测 多糖浓浓度，以管号为为横坐标标，多糖浓浓度为纵为纵 坐标标作图图Your site hereCompany Logov二、SephadexG-100凝胶柱层层析纯纯化LCP将离子交换换柱层层析分离得到的LCP高峰组组分进进一步用SePhadex G—100凝胶柱层层析纯纯化以0.lmol/L、pH7.0的磷酸盐缓盐缓 冲液为为流动动相，流速 0.2ml/min，每管2 ml苯酚硫酸法跟踪检测检测 ，绘绘制洗脱曲线线合并多糖含量高的组组分，透析、浓缩浓缩 、真空冷冻冻干燥，得LCP纯纯品Your site hereCompany Logo三、LCP纯纯度测测定1 Sephadex G-200凝胶柱色谱谱法称取LCP样样品 10 mg，溶于最小体积积的 0.2mol/L NaCl中，上Sephadex G—200 凝胶柱 ，分部收集 。

用 0.2mol/L NaCl洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测检测 ，以接收管数为为横坐标标，吸光度为纵为纵 坐标标，绘绘制洗脱曲线线若为为形状对对称的单单一峰，则则表明为为均一组组分Your site hereCompany Logo2 比旋光度法将LCP样样品溶于水，用无水乙醇沉淀，使溶液中乙醇的质质量分数为为20%，离心收集沉淀;上清继续继续 滴加乙醇使溶液中乙醇的质质量分数为为40%，离心收集沉淀前后两次沉淀冻冻干后在相同条件下测测定其水溶液的比旋光度Your site hereCompany LogoLOGOThank You! Add Your Company Slogan。