荧光原位杂交技术ppt课件.ppt

荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术第一节第一节 原位杂交技术简介原位杂交技术简介第二节第二节 荧光原位杂交技术的应用荧光原位杂交技术的应用第三节第三节 原位杂交操作步骤原位杂交操作步骤第四节第四节 影响杂交的因素影响杂交的因素第五节第五节 荧光原位杂交技术的新进展荧光原位杂交技术的新进展原位杂交技术简介in situ hybridization 原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则，原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则， 将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNADNA互补配互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细胞或组织上的位置显示出来的一项技术胞或组织上的位置显示出来的一项技术　　　　该技术最早是　　　　该技术最早是ParduePardue and Gall (1969) and Gall (1969)和和John et al. (1969)John et al. (1969)分别独立建分别独立建立起来的。

当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列立起来的当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列DNADNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分重在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分重要的技术手段尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对的要的技术手段尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对的DNADNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技术的序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术原位杂交操作步骤原位杂交操作步骤一、准备载玻片和固定材料一、准备载玻片和固定材料二、二、染色体标本制备染色体标本制备和和预处理预处理三、探针制备及三、探针制备及标记标记四、四、染色体标本变性染色体标本变性五、五、杂交杂交六、六、杂交后洗脱杂交后洗脱七、七、免疫细胞化学检测免疫细胞化学检测八、荧光显微镜观察及显微摄影八、荧光显微镜观察及显微摄影染色体标本制备染色体标本制备预处理预处理1、、RNA酶处理酶处理 1） 每张玻片加100 μl 100 μg/ml RNase A (in 2x SSC) 37℃处理1小时 2）用2x SSC洗3×5min 3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟2、、胃蛋白酶处理胃蛋白酶处理 1） 0.005-0.02% pepsin（10 mM HCl） 37℃处理10 min 2） 1×PBS洗2×5min 3） 1×PBS，50 mM MgCl2处理5min 4） 1×PBS，50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5） PBS洗涤并脱水,气干非放射性标记法非放射性标记法n 直接法¨荧光素（fluorescein）或其他荧光染料n 间接法¨地高辛（digoxigenin）¨生物素（biotin）1. 随机引物法随机引物法2. 缺口平移法缺口平移法3. PCR法法4. 寡核苷酸末端标记法寡核苷酸末端标记法5. 直接在探针直接在探针3’或或5’端合成端合成1. 0.5ml离心管中加入离心管中加入1ug探针探针DNA,加水置体系为加水置体系为16ul2. 沸水浴中变性沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中马上置于冰水中3. 加入加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/μl Klenow enzyme; 5x random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP) 4. 混匀离心，置于混匀离心，置于37℃温育温育1小时小时~20小时小时5. 65 ℃处理处理10min终止反应终止反应染色体标本变性染色体标本变性n共变性共变性¨杂交液加到标本上封片，置杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中烘箱中10分钟分钟n分别变性分别变性¨70%甲酰胺，甲酰胺，2xSSC 70 ℃处理处理2分钟分钟¨70%，，85%，，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥冷乙醇系列脱水，空气干燥1. 杂交液杂交液(50% 去离子甲酰胺去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚硫酸葡聚糖糖, 50 mM 磷酸钠磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针，每中加入标记的探针，每10ul杂交液含杂交液含50ng探针探针2. 探针探针95 ℃变性变性5分钟，置冰水中分钟，置冰水中10分钟分钟3. 10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片4. 湿盒中湿盒中37℃杂交过夜杂交过夜杂交杂交1. 2x SSC, 50%甲酰胺甲酰胺45 ℃洗洗3x5min2. 2x SSC 37℃洗洗2x5min3. TNT buffer [100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20] 37℃洗洗1x5min杂交后洗脱杂交后洗脱1. TNT buffer冲洗冲洗2. TNB buffer[100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl,0.5% blocking reagent]3. Anti-DIG-荧光素荧光素(2 μg/ml, in TNB)37℃30min4. TNT buffer冲洗冲洗3x5min5. 乙醇系列脱水乙醇系列脱水,气干气干6. DAPI染色染色10min7. 加加Vectashield封片封片,荧光显微镜下观察并照相荧光显微镜下观察并照相免疫细胞化学检测免疫细胞化学检测影响杂交的因素n一、影响杂交的主要因素¨温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺n二、其他因素¨探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗脱严谨度n三、标准杂交条件FISH技术的应用技术的应用n基因定位基因定位n染色体结构变异染色体结构变异( (异位、缺失、重复异位、缺失、重复) )研究研究n染色体物理作图染色体物理作图n疾病及产前诊断疾病及产前诊断n外源基因检测外源基因检测n多倍体起源进化研究多倍体起源进化研究n分子核型研究分子核型研究n染色体（质）空间结构研究染色体（质）空间结构研究荧光原位杂交技术新进展荧光原位杂交技术新进展nM-FISH，，armFISH(42-color M-FISH), SKYnBAC-FISH, YAC-FISHnFiber-FISHnPRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位引物原位DNA 合成技术合成技术nIS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位原位PCRnGISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交基因组原位杂交nImmuno-FISHn3D-FISHnQ-FISH（（Quantitative-FISH），），Flow-FISHnT-FISH（（Tissue-FISH））or (Telomere-FISH)nRNA-FISH Chromosome Lab5 5种荧光素联合标记人类种荧光素联合标记人类2424条染色体条染色体 荧光素荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y FITC ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆FITC ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆  Cy3 △ △ △ △ △ △ △ △ △ △Cy3 △ △ △ △ △ △ △ △ △ △  Cy3.5 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○Cy3.5 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○  Cy5 ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※Cy5 ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※  Cy7 ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆Cy7 ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆   光谱核型分析光谱核型分析（spectral karyotyping ,SKY)nSKY是另一种是另一种M-FISH,实验操作和结果与实验操作和结果与M-FISH相似。

相似n原始图像利用干涉仪产生干涉信号，再采用高性原始图像利用干涉仪产生干涉信号，再采用高性能能CCD数码相机进行拍摄，得到一组不同光程差数码相机进行拍摄，得到一组不同光程差的干涉图像的干涉图像 再将所得数据做再将所得数据做FFT(快速傅立叶快速傅立叶变换变换), 得到每一点的光谱信息得到每一点的光谱信息 通过分析光谱通过分析光谱信息，发现原始图像的信息信息，发现原始图像的信息 Chromosome Lab干涉仪干涉仪镜子收集光线收集光线标本标本发射光谱发射光谱CCD相机傅立相机傅立叶转换叶转换分析光谱信息分析光谱信息通过光谱分析准确分通过光谱分析准确分析析A图中的色彩分为相图中的色彩分为相近的三种染色体（近的三种染色体（C图）图） Chromosome Lab该技术操作简单，只需进行一次杂交，一次拍摄，该技术操作简单，只需进行一次杂交，一次拍摄，而传统而传统M-FISHM-FISH在拍摄过程中要变换多次滤光片在拍摄过程中要变换多次滤光片该技术灵敏度高，由于摒弃了传统M-FISH采用的以滤光片为基础的成像技术，在拍摄过程中全光谱通过，因此光通过量大大提高，从而提高灵敏度分析准确率高 ，整个分析基于光谱信息，所以准确率极高，即使是染色体末端的微弱信号，也同样可以采集到。

 Chromosome Lab利用利用SKY技术，准技术，准确判断出确判断出7号染色体号染色体和和12号染号染色体之间色体之间的交叉易的交叉易位 Chromosome LabG带分带分析得到析得到一条一条marker染色体染色体无法确无法确认起源，认起源，用用SKY确定来确定来源于源于18号 Chromosome LabFiber-FISHFiber-FISH DNADNA纤维的制备是先将单细胞纤维的制备是先将单细胞悬浮液涂在载玻片上，然后利用悬浮液涂在载玻片上，然后利用碱变性剂或碱变性剂或 EDTA-SDSEDTA-SDS缓冲液等化缓冲液等化学方法将染色体的结构破坏，让学方法将染色体的结构破坏，让DNADNA分子与复合的蛋白质分离而形分子与复合的蛋白质分离而形成游离的成游离的DNADNA纤维，再以这种失去纤维，再以这种失去空间结构的线性空间结构的线性DNADNA分子作为靶分子作为靶DNADNA的载体进行原位杂交，使分辨的载体进行原位杂交，使分辨率和灵敏度都有了很大的提高率和灵敏度都有了很大的提高 Chromosome Lab在不同靶在不同靶DNADNA上荧光原位杂交技术的比较上荧光原位杂交技术的比较靶靶DNADNA结构结构 分辨率水平分辨率水平 可检测可检测DNA DNA 优点和缺点优点和缺点 序列范围序列范围中期染色体中期染色体 1 1——3Mb >1Mb 3Mb >1Mb 保持染色体结构，切片容易制备保持染色体结构，切片容易制备 分辨水平低，识别染色体困难分辨水平低，识别染色体困难前期染色体前期染色体 200Kb >200Kb 200Kb >200Kb 保持染色体结构保持染色体结构, ,分辨水平居中分辨水平居中 切片不易制备切片不易制备, ,识别染色体困难识别染色体困难拉长的中期染色体拉长的中期染色体 200Kb >200Kb 200Kb >200Kb 保持染色体着丝点端粒结构，分辨保持染色体着丝点端粒结构，分辨 率水平居中，拉长染色体不均匀率水平居中，拉长染色体不均匀粗线期染色体粗线期染色体 100Kb >100Kb 100Kb >100Kb 保持染色体结构，识别染色体可能，保持染色体结构，识别染色体可能， 分辨率水平较高，切片不易制备分辨率水平较高，切片不易制备间期细胞核间期细胞核 50Kb 50Kb-2mb 50Kb 50Kb-2mb 分辨率水平高，切片容易制备，无分辨率水平高，切片容易制备，无 染色体结构，染色体结构，游离染色质丝游离染色质丝 10Kb 10Kb-1mb 10Kb 10Kb-1mb 分辨率水平高，无染色体结构分辨率水平高，无染色体结构DNADNA纤丝纤丝 1Kb 1Kb-1mb 1Kb 1Kb-1mb 分辨水平高，无染色体结构分辨水平高，无染色体结构基因组原位杂交（GISH）RNA-FISHT-FISH蚕豆蚕豆 红小豆红小豆 黄豆黄豆豇豆豇豆 绿豆绿豆小小麦麦水水稻稻玉玉米米金不换金不换 水仙水仙鼠杂交瘤鼠杂交瘤 猪猪水稻BAC-FISH日日本本晴晴AAFF。