原核表达调控-2分子生物学.pptx

二、 转录水平的调控,1. 转录调控的原理2. 原核生物转录调控的操纵子学说3. 乳糖操纵子与负控诱导系统4. 色氨酸操纵子与负控阻遏系统5. 其他操纵子6. 转录水平上的其他调控方式,4. 色氨酸操纵子(trp operon),trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控色氨酸合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程操纵子中各基因功能：trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的α和β亚基在许多细菌中，trpE和trpG，trpA和trpB分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质分支酸先在邻氨基苯甲酸合成酶作用下生成邻氨基苯甲酸，此后先与磷酸核糖焦磷酸中的磷酸核糖形成磷酸核糖邻氨基苯甲酸，经重排、脱羧和关环形成吲哚甘油磷酸，然后在色氨酸合成酶催化下先脱去3-磷酸甘油醛生成吲哚，最后吲哚与一个丝氨酸缩合形成色氨酸E.Coli中trp操纵子的结构 5个色氨酸合成代谢相关酶的基因构成一个操纵子合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群；受其上游的启动子P和操纵子O的调控。

这些基因只有在缺乏Trp时，才被有效表达trp操纵子,基因产物是5个酶，分别是邻氨基苯甲酸合成酶(E)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(D)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶-吲哚甘油磷酸合成酶(C)、 色氨酸合成酶β (B)和色氨酸合成酶α (A)色氨酸操纵元的调控机制,trp操纵元——属阻遏型操纵元，主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成色氨酸操纵子通常处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭4.1 辅阻遏蛋白的负调控,与lac操纵子的调控不同的是，控制trp操纵子的阻遏蛋白的效应物（ Trp ）不是一个诱导物（inducer）, 而是一个辅阻遏物（corepressor）也就是说，trp操纵子的调节基因的产物（阻遏物蛋白）无活性，不能与操纵基因结合；当Trp存在时，它与阻遏物蛋白结合，诱导该蛋白构象变化，能够结合在操纵基因上并阻止转录调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成型方式低水平表达调控蛋白R’，R’并无活性当提供足够的Trp时，Trp与R’结合使其构象改变而成为活性形式R，R可与操纵基因O特异性结合，阻遏结构基因的转录，R的阻遏能力仅为lac I产物的1/1000。

trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于95分钟处在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用大肠杆菌基因组定位是根据在接合过程中染色体转移时间确定的在接合过程中大肠杆菌基因组全部转移需要100分钟，不同的基因位点位于不同的 时间点上trpR,当有足够的Trp时，操纵子自动关闭细菌直接利用外界的Trp缺乏Trp时，trp操纵子被打开，5个结构基因表达，产生3个酶催化分支酸合成为Trp这是一种负性调控，操纵子通常是开放转录的当有效应物(Trp)作用时，诱导使阻遏蛋白R’构象发生变化，能够结合于操纵基因，则阻遏转录4.2 色氨酸操纵子的衰减调控,研究表明色氨酸操纵子存在两种机制的调控如果trp操纵子只受trpR编码的阻遏物调控，那么在缺乏或存在色氨酸时，trpR突变使trp操纵子表达的酶量应该是相同的可是，在trpR缺失突变体中，培养基中缺乏色氨酸比有色氨酸存在时操纵子的表达水平更高，说明色氨酸操纵子除受阻遏物调控外，还受另一机制的调控4.2.1 弱化子与前导肽,当阻遏物对trp操纵子的阻遏作用被解除，但细胞内仍有一定浓度的色氨酸时，第二种调控机制使trp操纵子的转录在抵达trpE之前被提前终止，这种现象称为弱化作用（attenuation），DNA中导致mRNA合成提前终止的一段序列称为弱化子（attenuator）。

弱化作用产生的关键在于trp mRNA的前导区在trp操纵子pTrp-O与trpE间有一段162bp的先导序列(leading sequence, L)在L内有一段123~150bp的序列，它在转录起始后可调控转录过程的进行这段碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录这个区域被称为弱化子，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构弱化子的共同特点是某些外部因素控制着弱化子的发夹形成，即形成终止子结构弱化子为结构基因的转录设了一道关卡前导肽分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，能产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽在前导序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制先导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，它编码了一个14个AA的先导肽编码先导肽的第10、11位是相邻的两个Trp密码子先导序列含有3对反向重复序列(A=1+2；B=2+3；C=3+4)。

如果B(2+3)形成发夹结构，A和C都不能再形成发夹结构当A（1+2）形成发夹结构时，B就不能形成发夹结构，却有利于C（3+4）生成发夹结构B,,,C后是poly(U)，即C实际是一个终止子，如果转录mRNA时它形成发夹结构，就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来mRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对终止构型,抗终止构型,无色氨酸时操纵子基因开始转录，此后转录速率受转录弱化机制(attenuation)调节在结构基因与 O 之间有一衰减子区域 ，该区域含有4段特殊的序列，高浓度色氨酸时能形成不依赖ρ因子的转录终止信号，RNA聚合酶脱落，转录终止低浓度色氨酸时则不能形成转录终止信号，转录继续4.2.2 弱化子的负调控,原核生物转录和翻译几乎同时进行，在Trp未达到能起阻遏作用的浓度时，从Ptrp起始转录，RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA，同时核糖体结合在mRNA上开始翻译当Trp水平高时，已经起始了转录的RNA聚合酶在特定的位点暂停，接着在到达trp E之前终止。

但当Trp缺乏时，聚合酶不终止，而是通读trp基因Trp合成酶类的量与Trp浓度呈负相关，这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关Trp浓度低时，生成Trp-tRNAtrp量少，使核糖体停止在mRNA上的Trp密码子UGG处；使A（1与2）不能形成发夹结构；而2+3形成发夹结构，阻止了3+4生成终止子；RNA pol可沿DNA继续转录，trp操纵子就处于开放状态Trp浓度高时，trp-tRNAtrp浓度随之升高，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2+3不能配对，而3+4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，结构基因被关闭而不再合成色氨酸Trp的存在对终止转录是有效的，弱化子仅允许约10%的RNA聚合酶通过 缺乏Trp时，弱化子允许所有的聚合酶通过当所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据A的序列，结果有利于1+2和3+4发夹结构的形成，于是RNA pol停止转录色氨酸操纵子代表了一种衰减调控模式,在trp操纵子上，弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓度a. 高色氨酸条件下，序列3和4配对，形成转录终止发夹。

b. 低色氨酸条件下，核糖体停在色氨酸密码子附近，序列1被核糖体覆盖，序列2和3配对，因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹c 没有蛋白合成时，如果没有核糖体起始先导肽的翻译，序列1、2形成发夹，阻止了2、3发夹的形成，允许序列3、4形成转录终止发夹，酶不表达实验证据,转录弱化理论得到了大量实验证据的支持：（1）影响区段3和区段4二级结构稳定性的突变以及改变区段4后面一串U的突变都会降低弱化子的终止作用，增加trp操纵子的表达，这与终止子的突变效应是一样的；（2）相反，影响区段2和3配对的突变，则增加弱化子的弱化作用；（3）如果前导肽的起始密码子发生错义突变，前导肽的翻译就不能起始，有利于前导RNA形成1－2、3－4二级结构，则转录必定在弱化子处终止有实验证明，在不加色氨酸的培养基中，trp mRNA的合成仍然受到部分阻遏，现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜，最终做出关闭或启动trp操纵子的决定，从而维持一定的色氨酸含量4.2.3 阻遏与弱化作用的协调,细菌中为什么需要弱化子系统呢？ 一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度较慢，需要一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。

或者，弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起trp操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨酸浓度那么为什么还要有阻遏体系呢？ 没有阻遏体系，只有弱化，似乎也可以调节色氨酸酶系的合成目前认为阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济 事实上，自然界存在着不同类型的合成体系，例如组氨酸操纵子拥有在功能上与trp操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节在trp操纵子中，阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，而对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，通过前导肽的翻译来控制转录的进行细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用5.1 半乳糖操纵子 (galactose operon),Galactose operon包括3个结构基因（gal E、gal T、gal K）表达产生的异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase)和半乳糖激酶(galactose kinase)参与Gal代谢，形成UDPGal，用于合成细胞壁。

5.1.1 半乳糖操纵子的结构及特点,激酶K,UDP转移酶T,差向异构酶E,,细胞壁,,当细胞中缺乏葡萄糖时，这些酶可使Gal转变成G-1-P，供细菌生命活动需要gal操纵子属于诱导型操纵子调节基因galR距离结构基因galE、T、K及操纵区O等很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同Gal是gal操纵子的诱导物Gal的跨膜运输需要galP基因产物的参与gal操纵子的特点：① 它有两个启动子，每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； ② 有两个O区，一个在P区上游-67—53（OE），一个在结构基因galE内部（OI）③ cAMP-CAP位点在-24~-50之间。