细胞生物学： 实验八 植物细胞骨架的光镜观察.ppt

实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察,问 题,细胞骨架的化学成分是什么？ 如何显现细胞内的骨架结构？ 如何显现微丝？ 如何显现微管？ 如何显现中间纤维？,细胞骨架的组成和分布,微管,中间纤维,微丝,微管 （微管蛋白）,微丝 （肌动蛋白）,中间纤维 （5种蛋白）,实验原理,用适当浓度的TritonX100处理细胞，可抽提掉细胞质内结合在细胞器膜结构上的蛋白质，而仅保存骨架蛋白，使细胞质背景清晰 经戊二醛固定，蛋白质的特异性染料考马斯亮蓝染色后，就可以观察到细胞质骨架的分布情况实验步骤,撕取洋葱鳞叶内表皮，约1cm2，置于小瓶中； 用磷酸缓冲液浸泡片刻； 1% TritonX100处理20-30分钟； M缓冲液洗3次，每次3分钟； 3%戊二醛固定15分钟； 用磷酸缓冲液洗3次，每次3分钟； 考马斯亮蓝染色15分钟； 蒸馏水洗2次； 置于载玻片上，盖上盖玻片，观察试 剂,M-缓冲液 咪唑（PH6.7） 络合剂调节离子浓度 MgCl2 离子强度和渗透压 KCl 离子强度和渗透压 EGTA 除去杂离子,维持pH EDTA 除去杂离子,维持pH 巯基乙醇 切断二硫键,维持还原 性,使蛋白质变性 M缓冲液不仅起洗涤的作用，而且有稳定细胞骨架的作用,螯合Ca离子,结 果,绘出洋葱鳞叶内表皮细胞内细胞质骨架的分布图。

结 果,实验注意事项,TritonX100 浓度和处理时间 抽提不足：背景深 抽提过分：细胞骨架被破坏 实验分组：TritonX100不处理组 TritonX100处理不同时间组 不要迷信权威的方法，方法需要调整和改良 用M缓冲液和磷酸缓冲液将各种处理溶液充分洗涤干净,结果记录和讨论,描述观察结果，并绘图; 完成实验报告; 阅读资料细胞骨架的荧光显微镜观察,标记荧光素的样品在荧光显微镜下经过不同波长的激发光激发，可发射出不同颜色的荧光可用于对特异蛋白质等生物大分子进行定性、定量的观察和分析DNA（绿色） 微管蛋白（红色）,荧光显微镜工作原理,滤光片1,滤光片2,激发光（短波长的紫外光）,发射光（长波长的荧光）,人上皮细胞：细胞核蓝色(DAPI) ；微管绿色(ALEXA 488)；微丝红色(Phalloidin/TRITC)； von Willebrand factor 颗粒 (ALEXA 350),微丝,中间纤维,微管,细胞质骨架是由微管（2025nm）、微丝（56nm）和中间纤维(711nm) 构成的细胞质内的网状结构，具有支持、运动、物质运输等功能动物细胞微丝的观察（阅读材料）,用磷酸缓冲液漂洗培养在盖玻片上的细胞； 3.7%甲醛溶液固定细胞10min； 磷酸缓冲液（ PBS）洗3次； 0.1%TritonX-100处理细胞15min； 磷酸缓冲液洗3次； FITC标记的鬼笔环肽室温避光反应40分钟； （鬼笔环肽与组成微丝的肌动蛋白结合） PBS洗去未结合的荧光染料，甘油封片观察。

洋葱鳞叶内表皮细胞骨架照片,免疫荧光技术,免疫荧光技术是将抗原抗体特异性结合的免疫性质与荧光标记技术相结合，来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法主要包括荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色和观察记录等过程二抗（带有标记物）,抗原,抗体（带有标记物）,抗原,一抗,间接免疫技术,直接免疫技术,动物细胞微管的观察,用微管蛋白的抗体（即一抗，例如兔抗微管蛋白抗体）与细胞一起温育，该抗体将与细胞质中的微管（抗原）特异性结合; 再加荧光素标记的一抗的抗体（即二抗，例如异硫氰酸荧光素FITC标记的羊抗兔抗体）共同温育，该二抗与一抗结合，从而使微管间接地标上荧光素； 在荧光显微镜下用一定波长的激发光照射，由荧光的所在显示出微管的形态和分布实验步骤,用磷酸缓冲液漂洗培养在盖玻片上的细胞； 0.5%TritonX-100处理细胞2min； 磷酸缓冲液洗2次； 3.7%甲醛溶液固定细胞30min； 磷酸缓冲液洗2次； 结合一抗，370C温育60min，洗涤； 结合二抗， 370C温育60min； 水洗，甘油PBS封片； 荧光显微镜下观察（由细胞核周围发出的微管布满细胞质，呈网状）动物细胞中等纤维的观察,用磷酸缓冲液漂洗培养在盖玻片上的细胞； -200C冷乙醇固定10min， -200C冷丙酮固定5min（丙酮能部分抽提膜脂，增加细胞膜的通透性，使抗体易于进入细胞）； PBS洗2次； 结合一抗，洗涤； 结合二抗，洗涤，封片； 荧光显微镜下观察（中等纤维交织成网状，在细胞核周围更致密）。