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高效液相色谱法测定维生素 C Prepared on 22 November 2020 高效液相色谱法测定维生素 C 的含量 【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析本实验中利用高效液相色谱法对维生素 C 进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素 C 进行定量检测 【关键词】高效液相色谱法、维生素 C、含量 1、 引言 维生素 C（VitaminC,Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300mg/100g。

溶于流动相（mobilephase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationaryphase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出高效液相色谱法（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChromatography，HPLC）HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件有的仪器还有梯度洗脱装置、脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置 2、 HPLC 测定维生素 C 的含量 、仪器试剂 、仪器 高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱(250mm×,；平头进样器。

、试剂 乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水 Vc 标准溶液：快速准确称取，用 1mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至 250mL 容量瓶中，用1mol/L 乙酸溶液定容，得到 100mg/L 标准溶液备用，现用现配 、色谱条件 流动相：3%的乙腈 LKH2PO4水溶液（v/v）；流速 1mL/min；柱温 30℃，紫外检测波长265nm；进样量 10μL 、实验步骤 、样品处理 1、按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数 2、样品准备：取 10 片维生素 C 片，研匀准确称取，用 1mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至 50mL 容量瓶中，用 1mol/L 乙酸溶液定容，用μm 滤膜过滤 3、标准曲线绘制：分别配制 5，20，50，80，100mg/L 的 Vc 样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定 3 次以 Vc 色谱峰面积对浓度作图，绘制标准曲线 4、定量分析：供试品溶液经μm 微孔滤膜过滤后进行 HPLC 分析平行测定 2 次，记录其Vc 的色谱峰面积，根据校准曲线计算维生素片中 Vc 的含量 5、实验结束后，按要求清理好仪器 3、数据处理 不同 Vc 浓度对应色谱峰面积图表 浓度 mg/L 5 20 50 80 100 峰面积 mAU*S y=R2= 1代入上式有 x=L 4、实验结果讨论 本实验中所采用的定量分析方法为外标法，即标准校正法。

该法直接，易于操作，计算简单但是标样与测定组分为统一化合物，分离、检测条件的稳定性对定量结果影响较大除此方法外，常用的定量分析方法还有内标法、峰面积归一化法至于定性分析，常用的方法为保留值定性，与已知物对照定性，还有安保柳枝经验规律定性此外还有选择性检测响应定性，色谱-结构分析仪器联用等方法 在分析未知物时，首先要知道这个化合物化学物理常数，然后选择合适的样品处理方法，使样品有较好的萃提回收率和较少的干扰成分存在；而对于分离分析，如果使用紫外检测器，在这之前应先做个化合物的吸收波长扫描，以找出其最大吸收波长，流动相先用纯水和乙腈或甲醇在不同比例时进行调节，保证出峰时无干扰和一定的分离度，然后依据峰形和化合物的pKa 值进行水相的 pH 值调节，以找到最佳的流动相体系 气相色谱仪具有分离选择性好、柱效高、速度快、检测灵敏度高、试样用量少、应用广泛等特点但气相色谱仪也具有一点局限性，在没有纯标样的条件下，对试样中未知物的定性定量较为困难，往往需要与红外光谱、质谱等结构分析仪器联用，对于飞沸点高、热稳定性差、腐蚀性和反应活性强的物质，气相色谱仪分析比较困难 高效液相色谱法与气象色谱法相似，具有高速、高效、高选择性、高灵敏度的特点，但仪器设备相对复杂，成本较高。

高效液相色谱法尚缺少灵敏度高的通用型检测器，而且使用有机溶剂作为流动相容易污染环境，梯度洗脱操作复杂。