氨基酸含量的测定及分离鉴定.ppt

实验七 氨基酸的分离鉴定,——纸层析法,,一 目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 二 原理 纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得 到分离的方法 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快 物质被分离后在纸层析图上的位置用Rf值表示 Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿距离 在一定条件下某种物质的Rf值是常数,,溶液前沿层析点 原点,溶剂前沿 苯丙氨酸 丙氨酸 天冬氨酸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,器材 1 层析缸 2 毛细管 3 喷雾器 4 培养皿 5 层析滤纸,操作步骤 1 取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2-3㎝处用铅笔划一条直 线，在直线上约每隔3-4㎝做一次记号，共记四次。

2 用毛细管将各种氨基酸样品分别点在4个记号点上，干后再点 一次尽量点成圆形，并在各点表上样品名 3 手通过纸将滤纸卷成圆筒形，并用针缝，共3针每缝一针打 个结，第三针的线留长一点 4 将缝好的纸（装入）垂直放入装有扩展剂的层析缸内（点样的 一端朝下，滤纸不应碰到缸壁） 5 约2个小时后，将滤纸取出，拆掉线后，放入烘干机内烘干，约10分 钟后取出即显色 6 画出溶液前沿线，确立个层析点中心，计算各氨基酸的Rf值,,实验结果:,,原点到溶剂前沿距离为L，原点到层析点中心距离为d,氨基酸的定量分析 —甲醛滴定法,一、目的： 初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点,水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量二、实验原理,若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量 脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。

三、材料、试剂与器具,（一）试剂 1、0.5%酚酞酒精溶液 称0.5g酚酞溶于100ml50%酒精中 2、0.1mol/L甘氨酸溶液 取3.75g甘氨酸溶于500ml蒸馏水 3、标准0.0200mol/L 氢氧化钠溶液 4、中性甲醛溶液 取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.01mol/LNaOH溶液， 使溶液呈微红色，临用前中和 （二）实验器具 锥形瓶 、碱式滴定管、移液管洗耳球、天平 容量瓶、试剂瓶、量筒、玻棒与烧杯,四、操作步骤,1、取5只50ml锥形瓶，按下表加入试剂2、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液变微红色 注意：滴定管中溶液的初始位置和滴定结束时的位置； 滴定管的使用方法,3、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液变微红色,4、记录每次滴定所用的0.0200mol/L NaOH溶液的 体积,五、计算,标准甘氨酸氨基氮的回收率=,,VNaoH*0.0200mol/L,理论计算值,*14.008,理论计算值:取用氨基酸的体积乘以浓度,再乘以14.008,VNaoH 两次测定所用氨基酸的体积的平均值,,每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为 式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）； V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）； MNaOH 标准NaOH溶液的摩尔浓度,1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？ 2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的 优缺点。

3、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上 的H+，不能用一般的酸碱指示剂？,思考题,。