响应面法优化广枣总黄酮的超声提取工艺研究.docx

    响应面法优化广枣总黄酮的超声提取工艺研究    刘霞等Reference：采用响应面法超声提取广枣[Choerospondias axillaris （Roxb.） Burtt et Hill]中总黄酮，在单因素试验基础上，利用Design-Expert 8.0、5.0软件设计响应面试验，研究乙醇溶液体积分数、液料比、超声时间和超声温度对总黄酮提取率的影响结果表明，广枣中总黄酮的最佳超声提取工艺参数乙醇溶液体积分数为62%，超声提取时间为55 min，液料比为35.00∶1（V∶m），在此试验条件下广枣总黄酮平均提取率为3.472%Keys：广枣[Choerospondias axillaris （Roxb.） Burtt et Hill]；总黄酮；超声提取；响应面法S665.1 ：A ：0439-8114（2015）09-2210-04广枣为漆树科植物南酸枣[Choerospondias axillaris （Roxb.） Burtt et Hill]的干燥成熟果实，又名五眼果、酸枣、山枣子等，是蒙古族常用药材[1]广枣性味甘、酸，具有行气活血、养心安神的功能，用于气滞血瘀、胸痹作痛、心悸气短、心神不安等病症的治疗。

广枣中的化学成分包括黄酮、有机酸、甾醇、香豆素、挥发油、酚酸类、多糖、氨基酸及多种无机元素等[2]广枣中的总黄酮是其有效成分，具有多种生理活性作用目前，广枣中黄酮类化合物的提取方法主要有醇提热回流法[3-5]、醇提渗漉法[6]及水煮提取法[7]等，且大多采用正交设计法研究其提取工艺本研究在单因素试验的基础上，使用响应面分析法[8，9]优化广枣中总黄酮的提取工艺，旨在为广枣的进一步研究开发提供科学依据和参考1 材料与方法1.1 材料、试剂与仪器广枣药材（毫州市中药饮片厂，批号130426），经赣南医学院药学院中药鉴定教研室程齐来教授鉴定芦丁标准品（A0103，含量≥98%，北京恒元启天化工技术研究院）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯PE Lambda 35 UV/VIS型紫外可见分光光度计（美国珀金埃尔默公司）；FW135型手提中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；JT2002型分析天平（上海精天电子仪器公司）；EYELAN-1001型旋转蒸发仪（日本东京理化器械）；EYELA A-1000S型水式真空泵（上海爱明仪器有限公司）；202A-2型电热干燥箱（上海阳光试验仪器有限公司）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试验方法1.2.1 标准曲线的绘制 精确称取11.15 mg芦丁标准品，用60%乙醇溶液溶解，定容于100 mL容量瓶中，摇匀，得到111.5 mg/L的芦丁标准溶液精确量取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10.0 mL容量瓶中依次分别加入60%乙醇溶液稀释至5.0 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min，再加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，迅速摇匀，静置6 min，最后加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇溶液稀释至刻度，充分摇匀放置15 min后，以不加芦丁的试剂作空白对照，测定波长为509 nm时的吸光度，得到吸光度（Y）与芦丁溶液浓度（X）的回归方程为Y=0.011 3X-0.001 7，R2=0.999 71.2.2 广枣总黄酮的超声提取 将广枣50 ℃恒温烘干后粉碎过40目筛，称取0.5 g，加入60%乙醇溶液15 mL，浸泡15 min后，在70 ℃下超声50 min，抽滤待样品冷却到室温后再重复处理1次合并滤液，用旋转蒸发仪回收溶剂，浓缩后用60%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中备用1.2.3 总黄酮含量的测定 吸取1 mL滤液于10 mL容量瓶中，按标准曲线的测定方法测定其吸光度，计算总黄酮含量和提取率。

1.2.4 单因素试验 ①乙醇溶液体积分数分析不同乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）对广枣总黄酮提取率的影响；②液料比分析不同液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL∶g）对广枣总黄酮提取率的影响；③超声时间分析不同超声时间（20、30、40、50、60、70 min）对广枣总黄酮提取率的影响；④超声温度分析不同超声温度（40、45、50、60、70 ℃）对广枣总黄酮提取率的影响1.2.5 响应面试验设计 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇溶液体积分数（A）、超声时间（B）、料液比（C）3个对总黄酮提取率影响较大的因素，对提取工艺条件进行响应面分析，试验因素及水平见表11.2.6 验证试验 对Box-Behnken中心组合试验优化后的广枣总黄酮提取工艺进行验证试验，重复3次2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1.1 乙醇溶液体积分数对广枣总黄酮提取率的影响 由图1可知，随着乙醇溶液体积分数的增大，广枣总黄酮提取率先逐渐增大，当乙醇溶液体积分数为60%时，其提取率达到最大，之后提取率反而下降，故取乙醇溶液体积分数60%为宜。

2.1.2 液料比对广枣总黄酮提取率的影响 由图 2 可知，当液料比达到30∶1时，广枣总黄酮基本溶出，继续加大溶剂量，总黄酮提取率增长比较缓慢，故选择液料比为30∶1为宜2.1.3 超声时间对广枣总黄酮提取率的影响 由图3可知，在超声时间20～50 min，广枣总黄酮提取率随着超声时间的延长而增加，50 min以后，总黄酮提取率变化不大，可能是由于超声时间的延长会破坏部分黄酮类化合物的结构，致使提取率变化不大综合考虑，超声时间为50 min为宜2.1.4 超声温度对广枣总黄酮提取率的影响 由图4可知，随着超声温度的增加，广枣总黄酮提取率呈上升趋势，70 ℃时总黄酮提取率达到最高；考虑到乙醇的沸点，温度过高时，溶剂会挥发，影响总黄酮的提取率，且试验仪器温度不能超过80 ℃，因此，选择超声提取温度为70 ℃2.2 广枣总黄酮提取工艺回归模型的建立及方差分析应用 Design-Expert 8.0、5.0软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，对试验结果进行响应面分析，得到了方差分析结果（表3）和响应曲面图（图5）通过多元回归拟合分析得到黄酮类化合物提取率（Y）与乙醇溶液体积分数（A）、超声时间（B）和液料比（C）之间的二次多项回归方程：Y=-2.795+0.162 5×A+0.130 5×B-0.200 5×C+（3.25E-003）×A×B+（1.85E-003）×A×C+（2.1E-003）×B×C-（3.313E-003）×A2-（3.65E-003）×B2+（5.5E-004）×C2。

由表3可以看出，回归方程的P2.3 验证试验考虑到实际操作的便利性，将最佳工艺条件调整为乙醇溶液体积分数62%，超声时间55 min，液料比35.00∶1，为了验证模型的可靠性和稳定性，在此试验条件下进行分析，广枣总黄酮平均提取率为3.472%（n=3）3 小结与讨论用超声法提取广枣中总黄酮，根据单因素试验结果，采用Box-behnken试验设计以及响应面分析对提取工艺进行优化，得出最优工艺参数为乙醇溶液体积分数62%，超声时间55 min，液料比35.00∶1，在此工艺条件下，广枣总黄酮提取率为3.472%（n=3）本方法与传统回流方法相比，不仅可以节省时间，还可提高提取率，是一种理想的提取广枣总黄酮的方法Reference：[1] 国家药典委员会.中国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010.[2] 邰文泉，白玉霞.蒙药广枣的提取工艺和化学成分研究新进展[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版），2006，21（1）：65-66.[3] 樊海燕，赛 音，敖登高娃，等.广枣中黄酮类化合物提取工艺研究[J].内蒙古大学学报（自然科学版），2005，36（1）：81-83.[4] 花仲卉，安雪梅，王伟内.比色法测定广枣醇提物中总黄酮的含量[J].海峡药学，2003，15（6）：36-38.[5] 黎瑞汝，苏智斌，陈 曦，等.正交试验优选广枣提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：47-49.[6] 谷福根，韩 磊，孟根达来，等.β-环糊精选择性提取广枣总黄酮的工艺研究[J].中药新药与临床药理，2011，22（1）：110-114.[7] 巴根那，吉林白乙，白玉霞，等.正交设计研究广枣总黄酮提取工艺[J].中成药，2000，22（4）：253-255.[8] 张秋龙，梁永欣，李主聪，等.响应面法优化细果角茴香中总黄酮的超声提取条件[J].天然产物研究与开发，2013，25（6）：841-845.[9] 杨 佳，张国尔，汪佳蓉，等.响应面分析法优化超声提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物的工艺研究[J].食品科学，2009，30（16）：94-97.  -全文完-。