多肽固相合成.docx

发明英文解释：solid phase peptide synthesis 简写为 SPPS在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是 R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径由于 R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖下面给出了肽固相合成途径 的简单过程（合成一个二肽的过程）氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭 基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上在三氟乙酸的作 用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了然 后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过 N,N '-二环己基碳二亚胺（DCC， Dicyclohexylcarbodiimide ）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已 接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就 生成了一个带有保护基的二肽重复上述肽键形成反应，使肽链从 C端向N端生长，直至达到所需要 的肽链长度最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键， 就得到了合成好的肽固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体 上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入 过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。

化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行 Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核 糖核酸酶1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素固相合成法的诞生多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程 1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相 当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护a 氨基，多肽合成才开始有了一定的发展到了 20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得 了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽 化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成 为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为 了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)因此，Merrifield荣获了 1984 年的诺贝尔化学奖Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基(Z) 在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护a-氨基并在固相多肽合 成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台多肽合成仪，并首次 合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。

1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护a-氨基， 其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条 件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽 自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善同时，固相 合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交 保护上也取得了丰硕的成果多肽合成仪的介绍多肽合成仪的诞生虽然Merrifield在发明固相多肽合成科学并取得巨大成功的同时，使用 了自主研发的合成设备，但却没因此将多肽合成仪引入市场 1970年，Beckman公司开发的全自动多肽合成仪 Beckman 990 Peptide Synthesizer 作 为第一台投入市场的科研用多肽合成仪，被美国多所大学的实验室采用几乎同一时间，Vega Biotechnologies, Inc.公司开发出两款经济型多肽 合成仪：Vega’s Coupler 1000 与 Vega’s Coupler 250 (不久又推出 Vega’s Coupler 296),其将多肽合成后续的切割理念结合到设备中，所有反应器 采用防爆玻璃材质，防止TFA的腐蚀。

被当时的肽化学界称为最经济适用 的多肽合成仪而今，Beckman与Vega’s两家公司均停止的多肽合成仪的研发与制造， 而转向到更多面的化学合成、分离、检测技术设备的研制产业中多肽合成仪的发展第一代多肽合成仪是以 Beckman公司推出的 Beckman 990 Peptide Synthesizer 以及 Vega’s Biotechnologies 公司推出的 Vega’s 296 Peptide Synthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代虽然随着生产工艺的改进和发展，如今第一代多肽合成仪已全部退出 了市场但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而 来，第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义第二代多肽合成仪是以 Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer 以及 Advanced ChemTech 公司推出的 ACT peptide synthesizer Model 90为代表的，诞生在上世纪八十年代此两款设备也是目前市场上 仍在销售的最早的多肽合成仪PS3的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌，即 合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出， 在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。

这样设计的好处是结构 简单，成本低，但反应相对温和：1）有时候多肽-固相载体在静电作用下会 “抱团”，使其不能与液相充分混合，在这种情况下需要调高氮气的压力以消 除静电作用；而在静电作用消除后要把压力立刻调低，不然的话较高的压 力会把多肽-固相载体“吹”到反应器液面上方由于多肽-固相载体具有较强 的粘壁性，一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来，也就是无法再参 加反应显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的，这就是造成反 应“死角”的重要原因反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度，有的 甚至造成合成的失败2）长时间氮气鼓泡会使溶液挥发，液面降低后一部 分多肽-固相载体就粘在液面上方，也无法再参加反应 3）氮气消耗量大，运行成本增大ACT90的设计原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动ACT的多肽合成仪同样具有反应温和的特点，即转动角度与速度都 不能够完全达到氨基酸耦合的极限，反应往往需要更长的时间第三代多肽合成仪是以 Applied Biosystems 公司的 ABI 433 peptide synthesizer与C S Bio公司的CS336为代表的无死角多肽合成仪为代表的， 诞生在上世纪九十年代。

ABI433的设计原理是反应器上方相对固定，而下方作圆周 360度快速 旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器 的最上方换句话说，溶液可以达到反应器内部的任意点，真正做到了无 死角由于搅拌速率可达每分钟1800转的高速，反应得以充分完全由于 无死角的搅拌方式保证的肽的合成纯度， ABI433型多肽合成仪（其退出多肽合成仪市场后最后一款仪器）至今在世界上还占有着很大的比例当然， ABI产品的售价也是最高的由于部件使用频率高，电磁阀会经常损坏， 而ABI将7个电磁阀做成模块化的设计，坏掉一个电磁阀必须要更换整个 模块，无形中增加了维修成本CS336的设计原理是反应器中点为圆心，上下做 180度旋转搅拌，搅拌速度可达180rpm，同时其采用了氮气鼓泡反应方式的优越性，将氮气吹 动作为可选反应方式融入反应方法中，多肽合成仪在科研领域的高耦合率 效果得到充分体现多肽合成仪的现状进入二十世纪以来，各大合成仪制造公司相继推出了升级产品和新产品，如Protein Technologies公司推出Tribute双通道多肽合成仪，将“短信 通知”功能融入产品，增添了用户与设备之间的紧密感，更加人性化；C S Bio 公司对其从研发型到生产型设备的 UV Online Monitor系统配置统一升级， 用户可直观看到每一部氨基酸偶联反应的状态并可根据数据调整出最佳合 成效果与工艺；Advanced ChemTech公司自2005年破产重组后分裂为两家 新公司，其中Aapptec延续了其前身的生产步骤，推出 Focus XC三通道合 成仪。

美国另一家公司CEM以蛋白质有机反应设备的制造著称，推出了微 波多肽合成仪同样可以合成简单的小分子多肽其采用微波加热方式，大 大提高了反应速度，将反应的速率增加到之前多肽合成仪的几倍甚至十几 倍可惜的是在加热的情况下副反应也相应增多，多肽纯度不能与之前的 第三代甚至第二代产品媲美另外，微波加热方法无法放大，故不适合用作多肽药物的研发活化基团Fmoc与tBoc多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧 基端）向N端（氨基端）合成固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯 的难度为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化固相合成方法有两种，即Fmoc 和tBoc由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用 Fmoc法合成具体合成由下列几个循环组成：1. 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine） 去除氨基的保护基团2. 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化活化的单 体与游离的氨基反应交联，形成肽键在此步骤使用大量的超浓度试剂驱 使反应完成循环：这两步反应反复循环直到合成完成3. 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。

树脂的选择及氨基酸的固定将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多 肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团）， 以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化 学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻 碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载 体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作 用用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯 -苯二乙烯交 联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入 反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸根据所导入反应基团的不同， 又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼 型树脂BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如 Merrifield树脂；FMOC合 成法通常选择羧基树脂如王氏树脂氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法 有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、 铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六 环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如 DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨 基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如 DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。

氨基、羧基、侧链的保护及脱除要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺 键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反 应完成后再将保护基因除去同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰 基类型作为a氨基的保护基，因为这样不易发生消旋最早是用苄氧羰基， 由于它需要较强的酸解条件才能脱。