基因功能的研究方法课件.ppt

基因功能的研究方法（一）基因功能的研究方法一、计算机预测基因功能二、实验确认基因功能1．基因失活基因失活是功能分析的主要手段1.1 基因敲除基因敲除（Gene knock-out）1.2 基因敲除的技基因敲除的技术术路路线线1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展1.4  基因失活的表型效应有时不易分辨2．转转座子突座子突变库变库的构建的构建2.1 插入序列2.2 实验步骤基因功能的研究方法3．内含子内含子归归巢突巢突变变4．基因的超表达基因的超表达用于功能检测5.       反反义义RNARNA5.1 反义RNA的分类和作用机制5.2  ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )5.3 反义RNA的功能5.3.1 调控细菌基因的表达5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制5.3.3   IS10转位作用的抑制5.4 人工合成构建反义RNA5.5 使反义RNA分子稳定的方法基因功能的研究方法三、其他的基因功能研究方法１．噬菌体噬菌体展示(phage display)２．酵母双酵母双杂杂交交 (yeast two-hybridization)  2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用  2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome    Protein Linkage Map）3.  开放开放读读框框顺顺序序标签标签(open-reading-frame sequence tags,OSTs） 基因功能的研究方法u确认DNADNA顺顺序序中的基因序列基因序列基因序列基因序列后，下一个问题就是探探探探知其功能知其功能知其功能知其功能，这是基因组研究的一个难度很大的领域。

u一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因基因基因基因组组内容内容内容内容比真实的情况少的多如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了大量常大量常规规的的遗传遗传学分析学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突突变鉴变鉴定定，但实际上还有很多空白•大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占43%43%至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%30%基因功能的研究方法一、计算机预测基因功能一、计算机预测基因功能Ø计算机预测基因功能的依据仍然是同同源性比源性比较同源基因都有1个共同的祖先基因，他们之间有许多相似的顺序同源基因可以分为2类：基因功能的研究方法Ø种种种种间间同源基因同源基因同源基因同源基因或直系基因直系基因直系基因直系基因(orthologous geneorthologous gene) 这是指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前的同一祖先Ø种种种种内内内内同源基因同源基因同源基因同源基因或平行基因平行基因平行基因平行基因(paralogous geneparalogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不多基因家族的不同成同成员员，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。

Ø同源基因同源基因同源基因同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为这两个基因在出现后独立的独立的发发生随机突生随机突变变，但它们有相似的相似的顺顺序序组组成成，大部分未未突变的核苷酸位置是相同的•当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从数据库中查找已知顺序的同源基因根据进进化的相关化的相关性性可从已知的同源基因已知的同源基因推推推推测测新基因的功能新基因的功能新基因的功能新基因的功能基因功能的研究方法 根据同源性预测基因时必需注意以下几点根据同源性预测基因时必需注意以下几点：1.一般认为aaaa的一致性的一致性或相似性相似性在25%25%以上以上以上以上可视为同源基因；2.同源性同源性同源性同源性与相似性相似性相似性相似性的含义不同，如aa顺序的80%的相似性不能称为同源性3.一致性一致性一致性一致性常指同一位置同一同一位置同一同一位置同一同一位置同一aaaa在整个多在整个多肽肽序列中序列中所占的比例所占的比例，而相似性相似性相似性相似性除一致性aa外还还包括可取包括可取代代aaaa的成的成员员，因此相似性aa的比例总是高于一致性aa基因功能的研究方法同源性分析可以给出整个基因或同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息某一区段功能的信息Ø同源同源同源同源查询查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA顺序翻译为aa顺序。

由于组成蛋白质的aa有20多种，而DNA核苷酸只有4种，因此aaaa顺顺序的差异序的差异要比要比核核苷酸的差异苷酸的差异大的多大的多大的多大的多Ø以以以以aaaa顺顺序序序序进进行同源性比行同源性比行同源性比行同源性比较较的结果更更更更为为准确准确准确准确，也更更更更加可行加可行加可行加可行已有许多软件可用于这项分析，常用的是BLASTBLAST研究者只要将资料以正确格式的电子邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得到回音基因功能的研究方法Ø有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部局部相似的区段相似的区段这种情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺序是功能的核功能的核功能的核功能的核心区域心区域心区域心区域Ø虽然基因本身基因本身基因本身基因本身无共同的祖先，但其功能域其功能域其功能域其功能域却有共同却有共同的起源的起源它们都是古老祖先的后裔，在进化中一方一方面面发发生生独立突独立突独立突独立突变变，另一方面又因基因基因基因基因组组重排重排重排重排成为新基因的组成部分例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2 2个基本的功能域个基本的功能域个基本的功能域个基本的功能域，即接受接受接受接受信号的功能域信号的功能域和传传达达达达信号的激信号的激酶酶域域。

 基因功能的研究方法二、实验确认基因功能二、实验确认基因功能 Ø同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能新基因的功能分析分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将同源性研究的结果进一步外延•如何确定一个基因的功能确定一个基因的功能确定一个基因的功能确定一个基因的功能是基因基因基因基因组计组计划划划划中最困难的问题之一•大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因未知基因的功能研究功能研究是远远不够的Ø基因的功能是一个过程，是从基因到表型基因到表型的一系列反应•传统传统的的的的遗传遗传分析分析分析分析是从表型出从表型出从表型出从表型出发发最终到达基因基因基因基因；•现现在的基因功能研究在的基因功能研究在的基因功能研究在的基因功能研究是从基因出从基因出从基因出从基因出发发直接推导表型表型表型表型因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别鉴别与目与目标标基基因相关的因相关的表型表型表型表型基因功能的研究方法1．基因失活是功能分析的主要手段Ø传统的遗传分析主要借助突突突突变变型型型型研究表型表型变变异的异的遗传遗传基基础础，利用紫外紫外线诱导线诱导及化学化学试剂试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从自然的群体中自然的群体中发发现现突变体。

Ø经遗传分析将突将突将突将突变变基因定位基因定位基因定位基因定位，然后观察这这一突一突变变体是否与改体是否与改变变的表型的表型对应对应在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目分离与克隆目标标基因基因功能的研究方法Ø所谓定位克隆定位克隆定位克隆定位克隆就是根据与突与突变变位点位点连锁连锁的分子分子标标记记，然后通过物理图寻找靶位点靶位点Ø上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基从基因到表型的研究因到表型的研究如果我们能找到某种方法，根据待待待待测测基因的基因的基因的基因的顺顺序序序序使生物体内使生物体内该该基因失活基因失活基因失活基因失活，亦可鉴别由此产生的表型表型表型表型变变异异异异基因功能的研究方法1.1 基因敲除基因敲除（（Gene knock-out））Ø概念：基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变    即可以是用突突变基因基因或其它基因其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因基因功能的研究方法Ø基因敲除是80年代后半期应用DNADNA同源重同源重组组原理原理发展起来的一门新技术80年代初，胚胎干胚胎干胚胎干胚胎干细细胞胞胞胞（ESES细细胞胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

•1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础•到1987年，Thompsson首次建立了完整的完整的ESES细细胞胞基因敲除的小鼠模型基因敲除的小鼠模型此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善基因功能的研究方法1.2 基因敲除的技基因敲除的技术路路线如下：①构建重组基因载体；②用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内；③用选择培养基筛选已击中的细胞；④将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测基因功能的研究方法 Note:ü基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠小鼠ESES细细胞胞基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源外源DNADNA与靶靶细细胞胞DNADNA序列序列自然发生同源重同源重组组的机率非常低，约为百万分之一百万分之一百万分之一百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作因此，同源重同源重同源重同源重组组的的的的筛选筛选和和和和检测检测就成了基因敲除技术所要解决的关关关关键问键问题题ü目前已有多种多种多种多种筛选筛选方法方法方法方法，其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的"正正正正负负双向双向双向双向选择选择系系系系统统"适用范围宽且效率较高。

基因功能的研究方法1.3 基因敲除主要基因敲除主要应用用领域及国内外研究域及国内外研究进展展基因敲除的应应用用领领域域主要有：①建立人类疾病的转转基因基因动动物模型物模型，为医学研究提供材料；②改造改造动动物基因型物基因型，鉴定新基因和/或其新功能；③治治疗疗遗传病；④改造生物、培育新的生物品种新的生物品种    基因功能的研究方法•ESES细细胞基因敲除途径胞基因敲除途径胞基因敲除途径胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术的成熟，首次使体外精体外精细细的基因操作的基因操作与小鼠的整个生生长发长发育育和生命生命过过程程得到了直接的结结合合合合，为探讨高等动物基因基因组结组结构和功能构和功能提供了有效的方法•由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学产生了极大影响•理论上，基因敲除可适用于任何能任何能产产生生ESES细细胞的胞的物种物种，将来可在小鼠基因敲除成熟的基础上开展其它其它实验动实验动物的基因敲除物的基因敲除工作基因功能的研究方法①①建立人建立人类疾病的疾病的转转基因基因基因基因动动物模型物模型物模型物模型，，为医学研究提医学研究提供材料供材料       基因敲除小鼠是研究疾病的疾病的发发生机理生机理、分子基分子基础础及诊诊断治断治疗疗的重要实验材料。

如1989年囊性囊性纤维纤维化病化病（CFCF）的致病基因（CFTRCFTR）被成功地克隆；1992年成功建立了CFTRCFTR基因基因的基因敲除的CFCF小小鼠模型鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了基因治基因治疗疗的动动物物试验试验；于1993年开始临临床床试验试验并获得成功基因功能的研究方法②②改造改造动物基因型，物基因型，鉴定新基因和定新基因和/或或其新功能，研究其新功能，研究发育生物学育生物学Ø深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能基因的功能和生物效生物效应应提供模式Ø例如，目前人人人人类类基因基因基因基因组组研究研究研究研究多由新基因序列的新基因序列的筛选检测筛选检测入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因缺失基因缺失引起的表型变化目前已报道了多种学习、记忆以及LTPLTP、、LTD LTD 有缺陷的基因有缺陷的基因敲除敲除动动物物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少基因功能的研究方法 ③③治治疗遗传病病      这包括去除去除多余基因多余基因或修修饰饰改造改造原有异常基因原有异常基因以达到治疗的目的。

③③改造生物、培育新的生物品种改造生物、培育新的生物品种      细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技基因敲除技术术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃飞跃这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景 基因功能的研究方法1.4  基因失活的表型效基因失活的表型效应有有时不易分辨不易分辨Ø通过上述种种方法得到的携携带带失活基因失活基因的品系与个体后，下一步工作就是检测检测突突变变体表型体表型以便指指认认未知基因未知基因未知基因未知基因的具体功能具体功能这一步也会遇到难题，生物表型范畴很广生物表型范畴很广Ø即使单细胞的酵母酵母酵母酵母，要确认一个未知基因一个未知基因对对表型表型的的贡贡献献，也可列出很长的一串名单Ø至于高等生物，因其某些表型某些表型具有难难以捉摸的以捉摸的综综合性合性，区分其准确的功能准确的功能准确的功能准确的功能更加棘手基因功能的研究方法 2．．转座子突座子突变库构建构建       转座子标签法又称基因基因基因基因标签标签(gene tagging)，通过构建插入突构建插入突构建插入突构建插入突变库变库系系系系统统，分离与克隆分离与克隆功能基因与功能基因与功能基因与功能基因与调调控控控控顺顺序序序序。

这一策略主要依据以下技术：•植物体体体体细细胞全能性胞全能性胞全能性胞全能性；•已经建立了一套成熟的转转基因系基因系基因系基因系统统，使外源基因在转基因植株中成功表达 基因功能的研究方法Ø植物中有许多转座子系统，它们的转座机制已经清楚，通过转转座子的随机插入座子的随机插入可获得大量的突大量的突大量的突大量的突变变型型型型，根据插入的转转座子序列座子序列座子序列座子序列合成探针，可分离被分离被破坏的位点破坏的位点，并分析它们的组成Ø转座子可以发生回复突回复突回复突回复突变变，从插入的座位脱离，使突变系重现野生型表型野生型表型基因功能的研究方法Ø目前应用的最成功的是玉米的Ac-DsAc-Ds转转座因子座因子座因子座因子系统基因标签突突突突变库变库的工作原理如下：Ø玉米色粒玉米色粒玉米色粒玉米色粒调调控元件控元件控元件控元件Ac-Ds 系统：第9 染色体 C  基因：色素合成基因 Ac Ac 基因：自主自主自主自主移动的调节因子，4.5 kb， 5 个exon， 编码转转座座酶酶 Ds 基因：非自主非自主非自主非自主移动的受体因子， 0.5－4.0 kb，与与Ac Ac 有同源序列有同源序列 ，插入引起色素不能合成。

　　　　　　　　　　基因功能的研究方法   2.1 插入序列(insertion sequence, IS)       仅含有转座酶基因转座酶基因的简单转移序列长度多在700－1500bp左右 由末端反向重复序列末端反向重复序列(IR)，转座酶基因组成插入基因组中时，在靶位上生成正向重复序正向重复序列列(DRDR)常见的IS结构 •IS      长度    末端IR           靶位DR            插入选择IS1    768        23                 9                         随机IS2    1327      41                 95                        热点IS4    1428      18              （12）         AAAN20TTTIS5    1195      16                 4                         热点IS10  1329      22                 9                  TNAGCN    IS50  1531       9                  9                         热点基因功能的研究方法2.2 实验步骤•将AcAc因子因子转座酶的编码基因转座酶的编码基因与组成型启动子如35S35S构建成嵌合基因表达载体嵌合基因表达载体，由于除去了除去了转座因子两侧的转座因子两侧的反向重复顺序反向重复顺序，转座酶的编码基因不能自我转座。

这一表达载体转化细胞获得的再生植株为再生植株为Ａ（Ａ（sAcsAc））• •外显子捕获载体外显子捕获载体构建：在转座子的边界顺序与标记基因之间插入内含子剪接受体顺序内含子剪接受体顺序，将它们转化细胞获得再生植株B B 基因功能的研究方法③将植株Ａ和植株B杂交，在转座酶的作用下来自植株B的转座子可以切离与转座当它们插入到某一外显子中时，基因转录加工后可能获得含正确读框的mRNA根据突变表突变表型型与标记基因标记基因的共分离共分离筛选转化无性系筛选转化无性系，通过自交自交可得到纯合纯合的不含转座酶基因的插入突变系不含转座酶基因的插入突变系④增强子捕获载体将核心启动子核心启动子TATATATA盒框盒框与标记基因标记基因编码顺序连接，然后在其两侧安装转座子边界两侧安装转座子边界，转化细胞获得再生植株再生植株C C将植株A与植株C杂交，在转座酶的作用下来自植株C的转座子可以转移到增强子下游启动标记基因表达采取类似4的方法分离纯合的插入突变系，进一步检测增强子的组织特异性表达场所基因功能的研究方法•上述方法用于拟南芥的基因打靶(gene targeting)取得了很好的效果，并已应用于水稻，玉米等作物的功能基因分离功能基因分离。

但它们也有2点不利之处：①插入突变往往是隐性隐性的，必须建立自交的自交的   F2F2代代群体群体才能找到突变株系；②植物基因组有大量的冗沉基因冗沉基因，它们可取代突变基因的功能，很多突变的效果不易鉴定改进方法为采用功能增益突变路线功能增益突变路线，即在转座子边界内部加入强启动子强启动子基因功能的研究方法3．内含子归巢突变Ø什么是内含子归巢? 在在I I类类II II类的某些内含子中含有类的某些内含子中含有开放读框开放读框，可产生具有三种功能的蛋白       这些蛋白可使内含子这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动移动(mobile)，使内含子内含子可插到一个新的靶位点可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢归巢（hominghoming）ØI组和II组内含子分布很广，在真核和原核细胞中都有发现基因功能的研究方法Ø在这些内含子的开放读框中编码具有三种功能三种功能的蛋白的蛋白，这些蛋白与与DNADNA或RNARNA的代谢有关的代谢有关①核酸内切酶：在在DNADNA的靶位点剪切的靶位点剪切，使内含子得以插入；②反转录酶：涉及将内含子RNA变成DNADNA拷贝拷贝；③成熟酶：从前体的从前体的RNARNA中切掉内含子中切掉内含子的部分。

基因功能的研究方法ØØ第第I I组内含子组内含子具有编码核酸内切酶核酸内切酶的开放读框；有时成熟酶成熟酶的活性和此蛋白有关ØØ第第IIII类内含子类内含子具有编码核酸内切酶核酸内切酶和反转录酶反转录酶的序列，另外成熟酶成熟酶的活性也与此蛋白有关在有些情况下还具有与其它酶活性相关联的成熟酶功能的遗传信息，成熟酶主要功能成熟酶主要功能是使内含子的构象使内含子的构象稳定稳定，这于剪接来说是很必要的基因功能的研究方法Ø现已知道有些第第I I组内含子组内含子编码核酸内切酶，它们的作用是帮助内含子在杂交中能插入到其不同等不同等位基因的座位位基因的座位中Ø在真菌的线粒体中普遍存在着内含子的多态性内含子的多态性或者缺乏内含子缺乏内含子，有种观点认为内含子来源于基因基因的插入的插入Ø通过分析酵母线粒体的大的rRNA基因在杂交中的重组，另一种观点认为以上的现象是基因的丢失基因的丢失基因功能的研究方法u在第第I I组内含子组内含子中含有编码序列这些内含子存在于“ω+ω+”的酵母酵母品系中，但另一品系“ω-ω-”中缺缺乏乏此内含子，将ω+和ω-进行杂交杂交其后代通常都是ω+ω+①如果我们将ω+ω+品系品系看作供体供体，将ω-ω-品系品系前成受受体体，我们从ω+×ω-杂交中会发现ω-基因组中产生了内含子的新拷贝内含子的新拷贝，结果使全部后代都表现为ω+。

②在两个亲本任何一个亲本任何一个都可发生突变突变而抑制以上的归巢归巢基因功能的研究方法③③突变突变的结果的结果使杂交后代中出现了正常分离正常分离，即ω+和ω-的后代中出现了正常分离，即ω+和ω-的后代数相等这种突变表明了这个过程的性质④在ω+的品系中突变突变发生在紧靠着内含子紧靠着内含子将要插入插入的位点的位点在ω- -品系中突变突变发生在内含子的开放读发生在内含子的开放读框框中，从而阻止了蛋白质的合成这表明在ω+ω+品系中的内含子编码的蛋白识别ω-ω-品系的靶位点品系的靶位点，将其切开，并将内含子的一个新拷贝插入切开的靶位点中，使之变成ω+品系，而且能稳定地遗传基因功能的研究方法•这种蛋白的作用是什么呢？ω ω内含子内含子的产物是一种核酸内切酶核酸内切酶，它能识别识别ω-ω-基因基因并将它作为靶点切开其双链这种核酸内切酶识别18bp18bp的靶序列，此含有内含子插入位点靶序列的剪切是在每条链插入位点的3’端这一侧2个碱基处交错切，这样剪切位点占4 4个个bpbp，产生了凸出的单链末端•这种类型的剪切是和转座子移到新位点的机制有关双链的断裂起始了基因的转变起始了基因的转变，在转变中ω+基因序列产生了一个新拷贝取代ω-基因，这个过程涉及通通过过复制机制复制机制进行转座进行转座，且仅在DNA水平上发生或以DNA取代的方式，或以模板转换的方式（与重组修重组修复复相类似）来完成。

要注意内含子的插入内含子的插入中断了内中断了内切酶对这个序列的识别切酶对这个序列的识别，这样使其稳定基因功能的研究方法•其它含有开放读框含有开放读框的第第I I类内含子类内含子也可以移动内内含子永久存在的机制含子永久存在的机制是相同的：内含子编码的核酸内切酶剪切内含子将之插入特殊的靶位点将之插入特殊的靶位点•插入的细节是有不同的例如T4噬菌体td内含子所编码的核酸内切酶就是在靶位点上游24bp处剪切，然后内含子本身插入这个位点，而不是其新产生的拷贝基因功能的研究方法•虽然内含子移动的机制是共同的，但靶位点的序列靶位点的序列和内含子编码区域内含子编码区域之间并无同源性无同源性据推测内含子有一个共同的进化区域，但很明显它们有很大的歧歧化化靶位点是在各种靶序列中最长的，对于核酸内切酶来说也是最特异最特异的结果内含子永久性地插入内含子永久性地插入到单个的靶位点中到单个的靶位点中，而且不插入基因组的任何其他地方，此就称为内含子归巢内含子归巢( intron homing)( intron homing)•含有编码核酸内切酶序列的内含子在不同细菌和低等真核生物中都有所发现由此产生一种游离的因游离的因子子，其编码的功能涉及到RNARNA的剪接的剪接或者DNADNA分子分子之间的移动之间的移动。

与此相关的观点认为内含子编码区域中密码子的用法与外显子稍有不同基因功能的研究方法•在第第ⅡⅡ类内含子类内含子中大部分开放读框都具有一个与反转一个与反转录转座子相关的区域录转座子相关的区域（除核酸内切酶编码区核酸内切酶编码区之外）这种类型的内含子在低等真核生物低等真核生物和某些细菌某些细菌中都有发现反转录酶反转录酶对于内含子来说是特异的特异的，而且和归和归巢有关巢有关反转录酶以初始mRNA为模板合成内含子的DNA拷贝，通过采用与反转录病毒相似的机制使内含子插入到靶位点中和这种情况有关的此种类型的反转录转座子与失去失去LTRsLTRs的一组反转录子是相似的在靶位点产生缺口缺口，形成的3′-OH3′-OH对于引发来说是需要的基因功能的研究方法•第第ⅡⅡ类内含子类内含子归巢的例子与前面介绍的反转录转座反转录转座子子转座的机制相似，内切酶在靶位点的双链靶位点的双链DNADNA上切一切口，在缺口上产生了3’3’末端末端为反转录酶提供了引物引物内含子RNA为cDNAcDNA的合成的合成提供了模板由于此RNA含有内含子两侧的外显子的序列，所以此cDNA要比内含子本身长，它能跨越双链切口，结果是使内含子插入到靶位点。

基因功能的研究方法•将一种核糖核蛋白和DNA底物的一道温育在体内可产生移动系统这个核糖核蛋白含有一个带有第第IIII组内含子组内含子的RNA和它的蛋白产物它具有核酸内切酶活性，在恰当的靶位点交错切割双链交错切割双链核糖核蛋白的RNA和蛋白两种成份对于剪切都是需要的在催化中二者可能都有作用基因功能的研究方法•可移动的内含子似乎是被插入到先前存在的基因中它们可能进化为核内前体核内前体-mRNA-mRNA内含子内含子具有自我剪切的能力的内含子显示了剪接进化的重要作用例如它们能移动到核中并成为snRNA的祖先基因功能的研究方法•内含子归巢突变内含子归巢突变就是利用归巢特性，将它们插到大肠杆菌的质粒载体中，另外再将人类HIV病毒和CCR5基因靶位DNA构建到另一载体中当这2类载体在大肠杆菌或人类体外培养细胞中相遇，内含子RNA可以逆剪切方式插入到HIV和CCR5 DNA靶位中，而且表现为某种随机性当内含子反向插入基因内部时，由于不表达IEP，成为永久整合当内含子插入方向与IEP转录方向一致时，内含子可以继续转移破坏其他位点这一系统可望用于缺少同源重组系统生物的功能基因组研究缺少同源重组系统生物的功能基因组研究。

　基因功能的研究方法4．基因的超表达用于功能检测．基因的超表达用于功能检测 •基因功能的检测除了使其失活外还可让其过过量表达量表达，基因产物的不足不足与过过量量都会破坏这种平衡，表现生长与发育的异常异常异常异常•基因的超表达基因的超表达基因的超表达基因的超表达有两种技术：    1. 增加增加基因的拷拷贝贝数数；    2. 采用强强启启动动子子促使基因表达基因功能的研究方法 5. 反义RNAØ反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子这种反义RNA能与能与mRNAmRNA分子特异性地互补结分子特异性地互补结合，从而抑制该合，从而抑制该mRNAmRNA的加工与翻译的加工与翻译，是原核细胞中基因表达的调控的一种方式然而，许多实验证明，在真核细胞真核细胞中亦存在反义RNA，但其功能尚未全部明了Ø最近几年来通过人工合成反义RNA的基因，并将之导入细胞内，转录出反义RNA，即能抑制特定基因抑制特定基因的表达的表达，阻断该基因的功能阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用同时也暗示了该方法对肿对肿瘤实施基因治疗瘤实施基因治疗的可能性基因功能的研究方法5.1  反义RNA的分类和作用机制   下表总结了原核细胞内天然存在的天然存在的1111种反义种反义RNARNA。

这些反义RNA按其作用机制可经分为三三大类大类ØØⅠ Ⅰ类类：这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SDSD序列序列和/或编码区编码区，引起翻译的直接抑制翻译的直接抑制(ⅠAⅠA类类)或与靶mRNA结合后引起该双链该双链RNARNA分子分子对RNARNA酶酶ⅢⅢ的敏感性的敏感性增加增加，使其使其降解降解(ⅠBⅠB类类)基因功能的研究方法ØØⅡⅡ类类：这类反义RNA与与mRNAmRNA的的SDSD序列的上游序列的上游非非编码区结合编码区结合，从而抑制靶抑制靶mRNAmRNA的翻译功能的翻译功能其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合ØØⅢⅢ类类：这类反义RNA可直接直接抑制靶抑制靶mRNAmRNA的的转录转录基因功能的研究方法基因功能的研究方法 5.2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA ØØticRNAticRNA是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMPcAMP结合蛋白结合蛋白)的mRNA的反义反义RNARNAticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活，从CAP mRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始，以CAP mRNACAP mRNA的模板DNA链的互补链为模板，合成ticRNA。

基因功能的研究方法ØticRNA具体长度不清楚，但是它是5’5’端一段端一段正好和CAP mRNACAP mRNA的的5’5’端端有不完全的互补不完全的互补，可以形成双链的RNA杂交体而在CAP mRNA上紧随杂交区之后的是一段约长11bp的A，U丰富区这样的结构十分类似于ρ不依赖性的转录终止子的结构，从而CAP CAP mRNAmRNA的转录的转录刚刚开始不久后即迅速终止从这个例子中我们可以看到CAPCAP蛋白合成的自我调节作用蛋白合成的自我调节作用当CAP合成达一定量后，即可与cAMP结合成cAMP-CAP复合物再激活激活ticRNAticRNA的启动子的启动子转录出转录出ticRNAticRNA，反过来反过来抑制抑制CAP-mRNACAP-mRNA的合成的合成基因功能的研究方法   5.3 反义RNA的功能u在原核生物中反义RNA具有多种功能，例如调控调控质粒的复制质粒的复制及其接合转移接合转移，抑制抑制某些转位因子的转转位因子的转位位，对某些噬菌体溶菌溶菌- -溶源状态的溶源状态的控制控制等u 下文仅举数例：基因功能的研究方法   5.3.1   调控细菌基因的表达Ø反义RNA对编码CAP基因的调控作用已如前述。

这里再介绍一下micF RNAmicF RNA对ompF基因的表达的调控ompFompF蛋白质是大肠杆菌的外膜蛋白外膜蛋白的主要成分这一micF RNA是从另一基因(ompCompC基因)附近的DNA序列转录而来，和ompF mRNAompF mRNA的5‘端有70%70%的序列互补，因此在体外micF RNAmicF RNA可以抑制ompF mRNAompF mRNA的翻译Ø但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问，因为缺失micF基因的菌株其ompF蛋白的表达只受到轻微的影响基因功能的研究方法 5.3.2  噬菌体溶菌/溶源状态的控制ØØ反义反义RNARNA也参与了λ和P22噬菌体的溶菌溶菌/ /溶源状态溶源状态的控制P22噬菌体编码一种抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白AntAnt，它可以抑制许多λ样噬菌体的阻遏蛋白与DNA的结合这对于刚刚感染细胞的P22建立λ样原噬菌体原噬菌体(prophageprophage)是有益的Ø但是Ant必须在严格的控制下，否则AntAnt的过分表达的过分表达必将阻止溶源状态的建立，而成为溶菌性溶菌性的噬菌体Ant蛋白质表达的控制是利用反义RNA(sarRNAsarRNA)能与ant mRNA的翻译起源区互补结合，从而抑制抑制ant ant mRNAmRNA翻译成翻译成AntAnt蛋白蛋白。

基因功能的研究方法Ø在λ噬菌体中cⅡcⅡ蛋白蛋白控制着溶菌或溶源状态的选择cⅡ蛋白可以激活λPreλPre启动子启动子，该启动子控制的基因是λ噬菌体整合作用整合作用所必须的，且同时能抑制抑制λ λ噬菌噬菌体的体的复制复制ØØcⅡcⅡ蛋白蛋白的另一功能是延缓延缓λ λ晚期基因的表达晚期基因的表达，其作用机制是cⅡ蛋白激活激活PaQPaQ的启动子的启动子，转录出PaQRNAPaQRA是编码Q蛋白的mRNA的反义RNA因此，PaQRNA能与QmRNA配对杂交而抑制其翻译，而蛋白蛋白早已知道是晚期基因表达的激活蛋白晚期基因表达的激活蛋白ØØcⅡcⅡ基因本身的表达基因本身的表达还受到称为oopRNAoopRNA的反义RNA的调控oopRNA与cⅡ基因的3'端互补，但其具体作用机制尚不清楚基因功能的研究方法   5.3.3    IS10转位作用的抑制ØØoutRNAoutRNA是一种反义RNA，可以和IS10编码的转位转位酶酶mRNA(INRNA)5’mRNA(INRNA)5’端端结合而抑制其翻译抑制其翻译，当细胞内只有一个拷贝IS10时，只能生成很少量的outRNA，故转位酶仍可生成。

但当IS10的拷贝数增多时，outRNA愈来愈多，其控制作用亦明显增强，所以称为多拷贝抑制现象拷贝抑制现象这种现象可以防防止止IS10IS10的过量堆积的过量堆积引起的细胞损害基因功能的研究方法5.4 人工合成构建反义RNA       既然反义RNA在原核生物原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那末人工设计人工设计在天然状态下天然状态下不存在的反义不存在的反义RNARNA来调节靶基因的表达调节靶基因的表达，想必也是可能的这已在不少实验中得到证实①由于目前对靶靶mRNAmRNA的的SDSD序列的上游区序列的上游区的结构了解甚少，因此，在要设计ⅡⅡ类反义类反义RNARNA用于和靶mRNA SD序列上游区结合，以期达到调节该调节该mRNAmRNA翻译翻译的目的是比较困难的 基因功能的研究方法②②②②ⅢⅢ类类反义RNA是和和mRNAmRNA的的起始处起始处结合结合而形成类似类似ρ-ρ-不依赖性不依赖性的转录终止子的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达因此，要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出反义RNA，与该U序列上游的mRNA链互补，以形成ρ-不依赖性终止子。

理想的作用位点是在靶靶mRNAmRNA的的5' 5'端上游的非编码区端上游的非编码区，以免受核糖体的影响③只要靶基因的核苷酸顺序靶基因的核苷酸顺序已经知道，就可以人工设计出Ⅰ Ⅰ类类反义RNA有时还可设计同时具同时具有有Ⅰ Ⅰ类类和ⅢⅢ类反义类反义RNARNA功能的反义RNA基因功能的研究方法④我们还可以设计出天然存在的反义天然存在的反义RNARNA的反义反义RNARNA来这样就可以拮抗原始反义拮抗原始反义RNARNA对靶mRNAmRNA的抑的抑制作用制作用而达到激活激活或加强加强某个靶基因的表达的目某个靶基因的表达的目的的然而并不是所有的mRNA对其相应的Ⅰ类反义RNA都敏感例如：ü有的mRNAmRNA寿命很短寿命很短，只有1-2分钟，它们和反义RNA结合的机会较少，因而就较不敏感较不敏感反之，另一些mRNAmRNA则很稳定则很稳定，寿命可达十多分种，则其对对相应的反义相应的反义RNARNA的抑制作用就很敏感的抑制作用就很敏感ü此外，反义RNA本身的稳定性有很大的实际意义显然，稳定的反义稳定的反义RNARNA对靶对靶mRNAmRNA的调节作用比不的调节作用比不稳定的反义稳定的反义RNARNA要要好好。

基因功能的研究方法  5.5 使反义RNA分子稳定的方法u反义RNA 3’端带有茎环结构或类似ρ-不依赖性终止子结构时，可以稳定RNA分子　　基因功能的研究方法•Gorski等还发现在T4噬菌体的基因32 mRNAmRNA的的5’5’端上端上游的茎游的茎环结环结构构及其附近的序列附近的序列亦可稳定RNA分子所以在设计反义RNA基因时，最好将产生3’及5’端这种二级结构的序列克隆在反义RNA基因的两端•Hirashima等1986年发现，针对靶靶靶靶mRNAmRNA的的的的SDSD序列序列序列序列和AUGAUG区域区域区域区域的反义RNA，要比单纯对编码区域的反义RNA更为有效•1989年Hirashima又发现，针对SDSD序列和它的上游区序列和它的上游区域域（但不包括AUG）的反义RNA更为有效•在真核生物真核生物中，针对5' 5'端非端非编码编码区的反区的反义义RNARNA更有效更有效但也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效基因功能的研究方法现在设计反义RNA基因是时应注意几点总结如下：①①①①长的反义长的反义RNARNA并不一定不一定比短的反义RNA更为有效②在原核生物原核生物中针对SDSD序列序列及其附近区域的反义其附近区域的反义RNARNA可能更有效。

③在真核生物真核生物中，对应于5’5’端非编码区的反义端非编码区的反义RNARNA可能比针对编码区的反义RNA更有效基因功能的研究方法④尽量避免避免避免避免在反义RNA分子中出现自我互自我互补补的二的二级结级结构构⑤设计的反义RNA分子中不不应应有有AUGAUG或开放开放读读框框，否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合⑥进一步还可以将带有ribozymeribozyme结结构构构构的RNARNA连连在在反反义义RNARNA的的3' 3'端尾上端尾上，当反义RNA与靶mRNA杂交后，即可利用其酶酶活性活性活性活性来降解靶mRNA基因功能的研究方法u此外，为了增增增增强强反反反反义义RNARNA的作用的作用的作用的作用，还可以采取一些额外措施，例如：①由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂剂量依量依赖赖性性，所以在构建反义RNA基因时，要选择强强的的的的、可以可以可以可以诱诱导导的启的启的启的启动动子子子子以增强反义RNA本身的表达②构建许许多个反多个反义义RNARNA基因基因串串串串连连在一起，以得到线性重复的多拷贝基因，对提高反义RNA的表达也有利③③RNARNA酶酶ⅢⅢ可以降解降解RNARNA：：RNARNA杂杂交体交体，所以在构建反义RNA基因时，可将RNARNA酶酶ⅢⅢ的基因的基因的基因的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。

这样，当反义RNA与靶mRNA结合后，RNA酶Ⅲ即可将其降解这显然有利于反有利于反义义RNARNA的抑制作用的抑制作用基因功能的研究方法基因功能的研究方法基因功能的研究方法三、其他的基因功能研究方法三、其他的基因功能研究方法u基因失活基因失活基因失活基因失活与过过量表达量表达量表达量表达是研究基因功能的基本方法，但还有一些其他的方法可将基因失活及过量表达所知的结果进一步延伸延伸与深化深化，对蛋白质活性进行综合研究基因功能的研究方法 １．噬菌体展示１．噬菌体展示(phage displayphage display)Ø噬菌体展示是一项筛选技术，它将外源多外源多肽肽或蛋白蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达融合表达融合表达融合表达，融合蛋白将展展示在病毒示在病毒颗颗粒的表面粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内Ø噬菌体展示技术使大量随机多大量随机多肽肽与其DNADNA编码编码序列序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多多多多肽肽配体配体配体配体通过一种被称为淘淘淘淘选选（panning）的体外体外选择选择程序程序得以快速鉴定。

基因功能的研究方法Ø最简单的淘选程序，是将噬菌体展示噬菌体展示噬菌体展示噬菌体展示肽库肽库与包被有靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去先洗去未未结结合合噬菌体噬菌体，然后洗脱洗脱特异性特异性结结合合的噬菌体的噬菌体被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结结合合合合/扩扩增循增循增循增循环环，以富集那些可富集那些可富集那些可富集那些可结结合序列合序列合序列合序列经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结结合克隆合克隆合克隆合克隆进行定性 基因功能的研究方法Ø展示在噬菌体表面的随机随机随机随机肽库肽库可应用于许多方面，包括绘制抗原表位抗原表位图谱图谱、研究蛋白蛋白质质- -蛋白蛋白质质相互作相互作用用和鉴定非非肽肽配体的配体的肽肽模模拟拟物物生物活性生物活性肽肽分子的分子的鉴鉴定定既可通过对固定的固定的固定的固定的纯纯化受体化受体化受体化受体进行淘选，也可在完整完整完整完整细细胞胞胞胞上进行淘选蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段一段一段一段亲亲和和和和标签标签，然后选用特异特异特异特异性性性性的介介介介质质来区分区分区分区分切割切割和未切割的噬菌体未切割的噬菌体Ø另外，大的蛋白质分子，如抗体抗体抗体抗体、激素激素激素激素、蛋白蛋白蛋白蛋白酶酶抑抑抑抑制制制制剂剂、酶酶和DNADNA结结合蛋白合蛋白合蛋白合蛋白也可展示在噬菌体上，通过对随机突随机突变变文文库库的的筛选筛选，分离出各种具有亲亲和力和力或特异性改特异性改变变的突突突突变变体体体体。

基因功能的研究方法ØPhD-C7C噬菌体展示肽库试剂肽库试剂盒盒盒盒是将随机七随机七随机七随机七肽肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白衣壳蛋白衣壳蛋白衣壳蛋白(pIII)上而构建成的一个组组合文合文合文合文库库与其他NEB展示肽库不同的是，所展示的随机多肽两侧各有一个半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸在非还原条件下，这两个半胱氨酸自发地形成一个二二二二硫硫硫硫键键，使展示的多多多多肽环肽环化化化化，而PhD-7和PhD-12肽库则展示线线性多性多性多性多肽肽受限于二硫键环内的7肽库已被证实能识别抗原表位结构，D-D-氨基酸氨基酸靶分子的镜像配基及开发以多肽为基础的治疗药物基因功能的研究方法•二硫键环内的7肽表达在pIII的N N末端末端，第一个第一个第一个第一个半胱氨酸紧接于丙氨酸后，第二个第二个第二个第二个半胱氨酸后有一小段间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是野生型pIIIpIII蛋白蛋白该文库含有1.2×109个电转化序列（可能的随机七肽序列数为：20207 7=1.28×10=1.28×109 9），用10 μl本试剂盒提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生约200200个拷个拷贝贝。

•原始文库的大量大量测测序序结结果果表明该文库序列具有广泛广泛广泛广泛的多的多的多的多样样性性性性，无明显的残基位置偏嗜建议不要扩增原始文库来进行其他的淘选试验，因为一旦再扩增便可能会出现序列偏性序列偏性序列偏性序列偏性现象基因功能的研究方法２．２．酵母双酵母双杂交交 (yeast two-hybridization)    2.1 2.1 概念概念概念概念Ø酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用•酵母双酵母双酵母双酵母双杂杂交系交系交系交系统统是在真核模式生物酵母中酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白蛋白质质之之间间微微微微弱的弱的弱的弱的、瞬瞬瞬瞬间间的的的的作用作用也能够通过报报告基因的表达告基因的表达告基因的表达告基因的表达产产物物物物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度很高灵敏度很高灵敏度很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术基因功能的研究方法Ø酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物真核生物调调控控转转录录起始起始过程的认识•细胞起始基因转录需要有反式反式反式反式转录转录激活因子激活因子激活因子激活因子的参与。

反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4GAL4在结构上是组组件式件式件式件式的(modular)，往往由两个或两个以上结结构上可以分开构上可以分开，功能上相互独立的功能上相互独立的结结构构域域(domain)构成，其中有DNADNA结结合功能域合功能域合功能域合功能域(DNA binding domain,DNA-BDDNA-BD)和转录转录激活激活激活激活结结构域构域构域构域(activation domain，DNA-ADDNA-AD)基因功能的研究方法Ø这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不不不不能激活能激活能激活能激活转录转录，只有当被分开的两者被分开的两者被分开的两者被分开的两者通通过过适当的途径适当的途径在空在空间间上上较为较为接近接近时，才能重新呈现完整的完整的完整的完整的GAL4GAL4转录转录因子活性因子活性因子活性因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启的下游启动动子子，使启动子下游基因得到下游基因得到下游基因得到下游基因得到转录转录Ø大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳哺乳哺乳哺乳动动物物物物基因组编码编码的蛋白的蛋白质质之之间间的互作的互作，也可以用来研究高等植物高等植物高等植物高等植物基因基因组编码组编码的蛋白的蛋白质质之之间间的互作。

因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用基因功能的研究方法2.2 实验步步骤Ø根据这个特性，将编码DNA-BDDNA-BD的基因与已知蛋已知蛋白白质质BaitBait   protein的基因构建在同一个同一个同一个同一个表达表达表达表达载载体体体体上，在酵母中表达两者的融合蛋白融合蛋白BD-Bait proteinBD-Bait protein•将编码ADAD的基因和cDNAcDNA文文文文库库的基因构建在AD-AD-LibraryLibrary表达表达表达表达载载体体体体上•同时将上述两种载体转化改造后改造后改造后改造后的酵母，这种改造后的酵母酵母细细胞基因胞基因组组中既不能不能产生GAL4GAL4，又又不能不能合成LEULEU、TRPTRP、HISHIS、ADEADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长基因功能的研究方法Ø当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子功能重建的反式作用因子功能重建的反式作用因子功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因His、Ade、LacZ、Mel1，从而通过功能互功能互功能互功能互补补和显显色反色反色反色反应应筛选到阳性菌落。

•将阳性反阳性反阳性反阳性反应应的酵母菌株中的AD-LibraryAD-Library载载体提取体提取体提取体提取分离分离分离分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测测序序序序和分析分析分析分析工作Ø在酵母双杂交的基础上，又发展出了酵母酵母酵母酵母单杂单杂交交交交、酵母三酵母三酵母三酵母三杂杂交交交交和酵母的反向酵母的反向酵母的反向酵母的反向杂杂交技交技交技交技术术它们被分别用于核酸核酸核酸核酸和和文文文文库库蛋白之蛋白之蛋白之蛋白之间间的研究的研究的研究的研究、三种不同蛋白三种不同蛋白三种不同蛋白三种不同蛋白之之之之间间的互作研究和两种蛋白相互作用的两种蛋白相互作用的两种蛋白相互作用的两种蛋白相互作用的结结构构构构和位位位位点点点点•基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中基因功能的研究方法2.3  利用酵母双利用酵母双杂交交发现新的蛋白新的蛋白质和蛋白和蛋白质   的新的新功能功能Ø酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径当我们将已知基因作已知基因作为诱饵为诱饵，在在选选定的定的cDNAcDNA文文库库中中筛选筛选与诱饵诱饵蛋白相互作用的蛋白蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳阳阳阳性性性性酵母菌株中可以分离得到AD-LibraryAD-Library载载体体体体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在Genebank中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的与已知基因在生物学功能上的联联系系。

Ø另外，也可作为研究已知基因的新功能已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之已知基因之已知基因之已知基因之间间功能相关功能相关功能相关功能相关的主要方法基因功能的研究方法Ø例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein alpha-synuclein 蛋白蛋白为诱饵诱饵蛋白蛋白蛋白蛋白，利用酵母双杂交Clontech  Matchmarker System 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白新蛋白Synphilin-1Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病帕金森病帕金森病帕金森病的发病有密切相关Ø为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响影响影响影响或抑制抑制抑制抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双酵母双杂杂交技交技术术和基因修基因修饰饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点相互作用的位点研究它们之间的相互作用位点有利于基因治基因治基因治基因治疗药疗药物物物物的开发。

基因功能的研究方法2.4 利用酵母双利用酵母双杂交在交在细胞体内研究抗原和抗体的胞体内研究抗原和抗体的相互作用相互作用 Ø利用酶联酶联免疫免疫免疫免疫（ELISAELISA）、免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀（CO-IPCO-IP）技术都是利用抗原抗原和抗体抗体间间的免疫反的免疫反应应，可以研究抗原抗原和抗体之抗体之间间的相互作用的相互作用，但是，它们都是基于体体体体外外外外非非非非细细胞的胞的胞的胞的环环境境境境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用Ø而在细细胞体胞体胞体胞体内内内内的抗原抗原抗原抗原和抗体的聚抗体的聚抗体的聚抗体的聚积积反反反反应应则可以通过酵母双杂交进行检测基因功能的研究方法Ø例如：来源于矮牵牛的黄黄烷酮烷酮醇醇还还原原酶酶DFR与其抗体scFvscFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异ØGeert等利用酵母双杂交技术，将DFRDFR作为诱饵诱饵蛋蛋白白，编码抗体的三个可三个可变变区的基因区的基因分别被克隆在AD-LibraryAD-Library载体上，将BD-BaitBD-Bait载体和每种AD-AD-LibraryLibrary载体分别转化改造后的酵母菌株改造后的酵母菌株改造后的酵母菌株改造后的酵母菌株中，并检测报报告基因告基因告基因告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活活活活细细胞的水平上胞的水平上胞的水平上胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反抗原和抗体的免疫反应应。

基因功能的研究方法2.5 利用酵母双利用酵母双杂交交筛选药物的作用位点以及物的作用位点以及药物物对蛋白蛋白质之之间相互作用的影响相互作用的影响Ø酵母双杂交的报报告基因告基因能否能否能否能否表达表达在于诱饵诱饵蛋白蛋白与靶蛋白之靶蛋白之间间的相互作用的相互作用基因功能的研究方法Ø对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药药物干物干物干物干扰扰的方法，阻止阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的   例如：DengueDengue病毒病毒病毒病毒能引起黄黄热热病病、肝炎肝炎等疾病，研究发现它的病毒病毒病毒病毒RNARNA复制复制复制复制与依赖于RNA的RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶（NS5）与拓扑异构拓扑异构拓扑异构拓扑异构酶酶NS3，以及细细胞核胞核胞核胞核转转运运运运受体受体受体受体BETA-importinBETA-importin的相互作用有关研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列氨基酸序列如果能找到相应的基因基因基因基因药药物物物物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的基因功能的研究方法2.6  利用酵母双利用酵母双杂交建立基因交建立基因组蛋白蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map） Ø众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调协调和控制控制的。

基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系Ø通过基因基因基因基因组组的的的的测测序序序序和序列分析序列分析序列分析序列分析发现了很多新的基因基因和ESTEST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因已知基因已知基因已知基因和ESTEST序列序列序列序列为诱饵诱饵，在表达文表达文库库中筛选与与诱饵诱饵相互作用相互作用的蛋白蛋白蛋白蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因基因基因基因组组蛋白蛋白蛋白蛋白连锁图连锁图这对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义基因功能的研究方法图1 　酵母双杂交系统基本原理基因功能的研究方法图2 　酵母双杂交系统的实验基本过程基因功能的研究方法 3.  开放开放读框框顺序序标签       (open-reading-frame sequence tags,OSTs) Ø已已经经完成基因完成基因组测组测序序的多多多多细细胞生物胞生物胞生物胞生物在基因注解时遇到的最大困难是，如何鉴别鉴别外外外外显显子子子子以及可可可可变变剪剪剪剪切的切的切的切的类类型型型型Ø线虫中预测的基因数18959个，检测到的EST的基因为9356个。

另外已知的完成测序的基因为784个，其中有637个与EST重叠，147个未发现EST因此可由实验确定的基因数为9503个，尚有98889888个个预预测测的基因未的基因未经验证经验证基因功能的研究方法ØReboul等为了检测根据ESTEST和外外外外显显子子子子/内含子内含子内含子内含子规律注解的基因是否真实，设计了一个称为开放开放开放开放读读框框框框顺顺序序序序标签标签的程序的程序的程序的程序(OST)(OST)检测基因产物：①挑选1222个未经验证的和376376个已知有个已知有ESTEST的的预预测测基因基因按照外显子设计双向引物双向引物双向引物双向引物，从线虫高高高高质质量量量量cDNAcDNA文文文文库库中中中中检测PCR产物，结果证实大多数的预测基因是正确的，也有未能检测到的基因②从这一实验的阳性与阴性结果推算线虫的总基因数应为17387个，比预测少8%将PCR产物进行测序，有12%的基因mRNAmRNA剪接方式剪接方式与预期的不同基因功能的研究方法。