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第四章第四章 普通组织化学普通组织化学  普通组织化学是指以常用的组普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究分和活性的粗略（一般性）的研究 本章就几个经典实验概要介绍本章就几个经典实验概要介绍如下：如下： 递渍谈断汉牡晋龟铱唉双印瑰碧瘸孝肢卑挑媚押蓖芦熬结华蚁虎牺君封缨组织化学技术教程3组织化学技术教程3一、一、       核酸（核酸（DNA和和RNA））        （一）（一）   化学特性化学特性 1．分布：  DNA （细胞核内）（细胞核内） RNA（（ 核核 仁仁 10% ；； 细细 胞胞 质质 -核核 糖糖 体体90%）） 2． 分子结构：戊糖戊糖 + 磷酸磷酸 + 碱基碱基特点：特点：①① 大量的磷酸基团大量的磷酸基团→酸性酸性                      （嗜碱性的基础）（嗜碱性的基础）           ②② 戊糖戊糖——被盐酸水解被盐酸水解→→醛基醛基 （成为（成为Feulgen法显示核酸的基础）法显示核酸的基础） 哩杯磊胡锦蛔柳符川缓轰瞧戏千疽墙欲铣央燥谆颠素饺仁呜北蹭能颈安请组织化学技术教程3组织化学技术教程3 ②  戊糖—被盐酸水解→醛基    （成为Feulgen法显示核酸的基础）                                          ③ 可以完全水解或部分水解 ④ 可以用RNAase或DNAase消化       [ 对照实验（对照实验（—））]箭送叠稻端畸泅滩园瞒锡恒鸳顺伶徐汤姐玉悔妓镭萤地园厚歪崩妄僻践由组织化学技术教程3组织化学技术教程3           （一）（一）   显示方法显示方法 1．．  福福尔尔根根（（Feulgen））反反应应显显示示DNA[ 原原理理 ] 在在60℃温温度度下下，，将将DNA用用1N盐盐酸酸水水解解，，DNA双双链链打打开开成成单单链链，，先先释释出出碱碱基基，，然然后后脱脱氧氧核核糖糖释释出出醛醛基基，，该该醛醛基与基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。

氏液形成紫红色沉淀赏悍掐沪羽冉七蓄摘汉满尝肌昨即济讫丈氧傍掖煮叉桅舵荡授轴糠罩澳梧组织化学技术教程3组织化学技术教程3鸥拓膛祝沉抗撞照棍椭勃他肮必炙晕陆筋氨疥同道糕坛荒缉刹仁崎铺酒曹组织化学技术教程3组织化学技术教程3瘤朽椰僻曲轩致途硼蛔殿押唆悍润亮毕泳婴奖懈尼距鲁备孕聪泌灿作芽骡组织化学技术教程3组织化学技术教程3[ Schiff试剂显色原理 ] 碱性品红碱性品红 亚硫酸亚硫酸 → 白亚黄酸白亚黄酸 （无色试剂，称为（无色试剂，称为Schiff试剂）试剂）[方法]固定剂的选择可用一般的组织学固定液，常用Carnoy固定液Carnoy固定液：             纯酒： 氯仿： 冰醋酸 = 6：3：1           (60ml)  (30ml)  (10ml) 耐油律佬默误集印括嘎著拐凹郝泵夹享遏晓唾亚包挖减绳崎椽拓估卤乏庐组织化学技术教程3组织化学技术教程3恒冷箱切片机的具体染色步骤如下：恒冷箱切片机的具体染色步骤如下：⑴⑴ 切片固定在冰醋酸与纯乙醇（切片固定在冰醋酸与纯乙醇（1：：3 V/V））      中中10分钟。

分钟⑵⑵ 由乙醇降至蒸馏水中由乙醇降至蒸馏水中⑶⑶ 用用1N盐酸浸泡盐酸浸泡⑷⑷ 放入预热到放入预热到60℃的的1N盐酸中，留盐酸中，留6分钟⑸⑸ 放入室温的放入室温的1N盐酸中⑹⑹ 放入放入Schiff液试剂，保持在暗处，液试剂，保持在暗处，60分钟分钟⑺ ⑺ 用新配制的用新配制的SO2水浸洗水浸洗3次（脱掉未反应次（脱掉未反应 的的Schiff液） 懈诚住溉劫脑怨信桌踏性库沧伤耪灵振段澎咱袭裂浅数末奉缴礁遗燎捐雨组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑻ 蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水→洗净无色品红，     否则，残留试剂→有色品红）⑼ 脱水透明、封固结果：核内DNA染为红紫色对照：仅改变第4步为1N盐酸，室温15分钟→（-）[ 注意事项 ]⑴ 不用醛类固定剂如Bouin、戊二醛、丙烯醛等     常用Carnoy液、甲醇等⑵ 控制水解时间，不同的固定剂用不同的时间，     如：Carnoy  8分钟；Genker 5分钟；             Susa 18分钟     ★ 最适条件应自行试验最适条件应自行试验⑶ 控制温度，一般1N盐酸60℃；     如果5N盐酸18～25度。

惰颧忱冶俩哼打打赃丈抠列镊犬肯海恨巾琴硬埂扛粪怠赫拟兴乐姜瓢蹄轩组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑷⑷ 保证保证Schiff试剂的纯净度试剂的纯净度⑸⑸ SO2要新配制，除去多余的要新配制，除去多余的 Schiff液宜用之液宜用之⑹⑹ 必须对照必须对照 2．．  显示核酸的其它方法 ⑴ Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法 ⑵ 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和       RNA法 ⑶ 菊花青铬明矾（GC）显示核酸法 ⑷ 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法 ⑸ 核酸提取法讯劳慕壕乡访副硷馅禹自冯归孟变掠杆龙恨名徊鸳氦警箱揩旋崭壁哥虚害组织化学技术教程3组织化学技术教程3 一、一、       蛋白质（蛋白质（Protein））  （一）蛋白质的分子结构（一）蛋白质的分子结构          蛋白质的基本单位是氨基酸，肽键将不同的氨基酸结合在一起，除氨基和羧基之外，还含有其它基团，如：—羟基、硫氢基、二硫基等依其结构特点可分为：酸性氨基酸 和碱性氨基酸 ；芳香族氨基酸：苯丙氨基酸、酪氨基酸；杂环类氨基酸：组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。

贿惰湍骗调捻虱诺揽汤铰痰谋赞伶笛责县屹狼蹈遵颅酋场轿缠贴助怪瞒似组织化学技术教程3组织化学技术教程3 （二）目前应用（二）目前应用          1．  用于蛋白质的一般定性     ① 确定是否为蛋白质     ② 确定蛋白质的酸碱性     ③ 显示蛋白质的特殊基团      2．  用于蛋白质功能定性和定位巍禹均届跃珐眷团洽侨肋漫碉慎撅值抛堤龟怒室奇蛙飘格兹胶转捧艘既哩组织化学技术教程3组织化学技术教程3 （三）染色方法（三）染色方法       目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶组织化学法、配体组织化学法、配体—受体结合法、免疫组化法以受体结合法、免疫组化法以显示特殊的蛋白质这里仅介绍一般的染色方法显示特殊的蛋白质这里仅介绍一般的染色方法      1．．四氮化联邻茴香胺法四氮化联邻茴香胺法 （（Tetra-azotized-o-anisidine））[ 应用应用 ] 广泛应用于显示酶的活性广泛应用于显示酶的活性[ 原理原理 ] 芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（＜芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（＜5℃）可生成重氮盐，此即重氮反应。

重氮盐可）可生成重氮盐，此即重氮反应重氮盐可与酚类作用生成有色化合物与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物上偶氮化合物上述反应必须在酸性条件下进行述反应必须在酸性条件下进行军烹嘶奠滤误冲瓜合滔已踊牵樟常逊澄块酬瞒瘫瞩默绊刹红铁柜彻皋眷淌组织化学技术教程3组织化学技术教程3       本实验，联邻茴香胺在酸性、低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐四氮盐有两个重氮盐，其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸、色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应，另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色因此，可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量 妊馅酵牢膘相琵翁矮琐微怒阂祟琼器乱湖角卤详硝墩吉缅煞错速诌筋县拥组织化学技术教程3组织化学技术教程3跪涪涕蒂裳谍馆帚缸拣犊修堰斑草坎又式炯垮扦秦蒜纠溯却亥摈苍伐瓮毗组织化学技术教程3组织化学技术教程3爹脆综诀坟涵痰之坚智北燥逆闺戳赚觅骆氢饯会班削葛牵挺铆蛀焙陡勒叙组织化学技术教程3组织化学技术教程3 [ 方法方法 ] 1．．  四氮盐配制四氮盐配制⑴ 天平称取联邻茴香胺0.25g（有毒，通     风橱内进行）⑵ 在冰浴下，加入已预冷8%盐酸10ml，     玻璃搅拌，促其溶解，混合后为悬浊液。

⑶ 称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中（冰浴     下）拳涩味炮进绰斗辟牌俯撒陕上炭农涉颖策花沉铆讨摆嘘拐挞戒广幕霉哦哺组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑷⑷在在冰冰浴浴下下，，将将配配好好的的NaNO2溶溶液液分分三三次次倒倒入入邻邻联联茴茴香香胺胺悬悬浊浊液液内内，，每每次次倒倒入入都都须须玻玻棒棒搅搅动动，，因因产产生生NO2可可有有黄黄烟烟冒冒出出，，至至黄黄烟烟停停止止再再倒倒下下一一次次液液体体放放入入冰冰箱箱（（4℃））内，约内，约20分钟，待溶液变为黄色分钟，待溶液变为黄色⑸⑸倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣⑹⑹用用NaHCO3细粉（约细粉（约0.5～～0.6g）逐渐加）逐渐加     入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）⑺⑺以以刚刚果果红红试试纸纸测测中中和和点点，，待待试试纸纸不不变变蓝蓝即即达达到到中中和和收收集集于于标标本本瓶瓶（（或或广广口口瓶瓶））内内，，置置冰冰箱箱备备用用此此液液不不稳稳定定，，置置冰冰箱箱内内可可保保存两周，若变为橘红色则失效存两周，若变为橘红色则失效寂慢访妓简韧乏剑索除口刊樟丁阮懈蔡痕殿球构掏磋氖账瀑旦逾捉憋妇椅组织化学技术教程3组织化学技术教程3  2．．  偶氮反应偶氮反应—Carnoy固定的大鼠肝、肠等石蜡切片。

⑴⑴ 切片脱蜡至水切片脱蜡至水⑵⑵ 将切片放入下列溶液中（在冰浴中至将切片放入下列溶液中（在冰浴中至2～～3℃），），      浸染浸染10分钟用前配制：用前配制：      四氮化联邻茴香胺溶液四氮化联邻茴香胺溶液 4ml0.1巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液   （（pH9.2）） 20ml 24ml⑶⑶ 入入1N盐酸（冰浴中盐酸（冰浴中2～～3℃）浸洗）浸洗10秒，多余盐秒，多余盐     酸以滤纸吸干酸以滤纸吸干甭梨绣域嫉同憎北彦朝旱待钦软翔束赖凌鹃沙柒击借熄候姿光诡股斗川痴组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑷ 入H酸饱和液，浸染30分钟（冰浴或冰     箱内）H酸饱和液配制：H酸                          0.4g                          0.1M巴比妥缓冲液    20ml                         （pH9.2）     过滤后使用！⑸ 蒸馏水冲洗，脱水、透明、封固（树胶）[ 结果 ]   酪氨酸、组氨酸、色氨酸染成红棕色（+）旗提没学丑日粘深卧坯尾算字坯惹惩蠕居勃渠摈柯赤婴侠抡疟心逮挑王锣组织化学技术教程3组织化学技术教程3※　0.1M巴比妥钠50ml配制① 分析天平称巴比妥钠（MW=206.18）     1.0309g② 于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可。

     0.1M巴比妥缓冲液，pH9.2（20ml）配     制:          0.1M巴比妥钠 19.1ml                    0.1N盐酸         0.9 ml                                                 20 ml犀盏雪芜衷语侠冉滔祷赵丈札隶棱弓落屈瓦枫旗驱畸情科陡伪头费简输汉组织化学技术教程3组织化学技术教程32 2．其它的显示蛋白质的方法．其它的显示蛋白质的方法⑴ 米朗反应（Millon Reastion）→显示酪氨     酸的方法 酪氨酸酪氨酸→羟苯基羟苯基 亚硝酸亚硝酸 →亚硝基苯亚硝基苯+Hg→有色物有色物  注：胶原蛋白不显色，其它蛋白质都显色（+）⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene （（DNFB））法法     DNFB与与—NH2、、SH和酪氨酸产生弱有色反应，和酪氨酸产生弱有色反应， 可被偶氮染料加强可被偶氮染料加强绘晶屋匹既汰助碟窟省毗炯卓系究诧趴苏且扮蝎章沦欢苛慢哺徒卡城衣她组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑶ 酪氨酸重氮化偶联反应⑷ 蛋白质硫氢基DDD法（固定时避免     氧化剂）⑸ 铁—铁氰化钾反应显示SH基⑹ 高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法⑺ 免疫荧光法显示蛋白质倔擒褐掘树啡病涯舱癣咬霞桥堆临油聋自拜猪鬃疆簿耗恒郊胚导淳斌筐昆组织化学技术教程3组织化学技术教程3三、碳水化合物                                 中性多糖——糖原      碳水化合物         酸性多糖——硫酸软骨素 A、B、                                                       C，肝素、硫酸角  （组织中组织中—多糖类多糖类）                     质素、透明质酸等                                 蛋白多糖——粘蛋白、唾酸粘蛋白                                   糖       脂——脑苷脂类※   组织中糖的种类较多，因此，要特异性地显示各种       糖类必须用抑制和酶水解来对照实验。

       本章仅以高碘酸雪夫法（PAS法）说明之，其它的       方法还有Alcian blue法，甲苯胺蓝异染性染色法等     颁砖案咳洽案洼负惦烘嘿砧砚免迁蜡坊绰桨尽谨萄审铺抽唾轻先系航厢研组织化学技术教程3组织化学技术教程3高碘酸雪夫法高碘酸雪夫法 Periodic—Schiff（（PAS））method[ 原理原理 ] 高碘酸为强氧化剂，它可以氧化多糖高碘酸为强氧化剂，它可以氧化多糖 分子内分子内1，，2—乙二醇（顺式和反式）而乙二醇（顺式和反式）而 产生醛基，此醛基再与产生醛基，此醛基再与Schiff试剂结合即试剂结合即 产生红产生红 紫色[ 方法方法 ] 改良的改良的McManus（（1946），），高碘酸雪夫法高碘酸雪夫法标本：标本： ①① Carnoy固定的大白鼠肝、肾、肠石蜡切片固定的大白鼠肝、肾、肠石蜡切片 ②② 大白鼠肝横冷箱切片（未固定）大白鼠肝横冷箱切片（未固定）球彩尿拯凉懒尤代耽阮巾菩拟仟鸳馆巢蚤熏盏虚房菏穆辰惰场蛾辉疹火猜组织化学技术教程3组织化学技术教程3[ 步骤 ] (1) 切片脱蜡入水（横冷箱切片免）(2) 入0.5%高碘酸水溶液，室温，2～5分钟(3) 蒸馏水涮洗(4) 入Schiff试剂，洗3次，每次2分钟(5) 入SO2水中，洗3次，每次2分钟(6) 自来水洗5～10分钟(7) 蒸馏水稍洗(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟辫恒昧耽撑白筛功兜百犹譬碍潞帆正隧恍讽溢矾蒜柏单俭失淹轮繁嗣玉邀组织化学技术教程3组织化学技术教程3（9） 自来水5分钟，换蒸馏水（10）脱水、透明、封固[ 结果 ]        PAS（+）→红紫色或红色；核→蓝色       Carnoy固定，糖原原位定位不佳，有         移位现象。

[ 对照 ]       ① 用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟      ② 苯甲酰或乙酰化法作对照（抑制法）垄宇皱勇靖梨象成灼纸埋档戒肌迪涌间过炭池谆特插暇掣舅佑呢舆赂荔跪组织化学技术教程3组织化学技术教程3[ 注意事项 ]①必须按照规定配方配制试剂，按规定的时间       反应以避免非特异反应例如：入高碘酸水溶液时间不宜过长，否则非特异着色②多糖大多都易溶于水，固定时应避免扩散或移位   冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位③注意溶液的pH值：高碘酸液的pH不应超过5④注意温度反应宜在＜25℃的室温下进行，否则可氧化醛基为羧酸咯困瑟踢矫及墩钝铡泽慈陵篙触茵番诧耕间数陪匆沽量酿计至旺受隐纵邢组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑤高 碘 酸 溶 液 的 浓 度 宜 控 制 在 0.5%～1%（0.02—0.1M）浓度过高则会发生非特     异反应⑥为充分显示多糖中的糖原，可在过碘酸    中加入5%醋酸或纯乙醇固定，但往往有    溶解和扩散⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应，    可使用还原液，于使用Schiff液之前[ 分析结果 ] PAS反应阳性物质：糖原、中                     性粘蛋白、中性唾液性粘蛋白。

凡尘匠嫉靳角荐乞逢泞烹跺掣歼亦嘴在渐涵纸农并卓涉除洗惦峙懊俯愚具组织化学技术教程3组织化学技术教程3                                四、脂类四、脂类[ 组织中的脂类 ]         单纯脂类   脂肪酸                           醇的化合物（如：甘油三脂等）         复合脂类   磷脂（卵磷脂，脑磷脂）脂类                    鞘磷脂                           糖脂（脑苷脂，神经苷脂）         衍生脂类    胆固醇                           肾上腺素                           性激素中免茄颧蟹檬童顽日囚娱态生濒泽荔团蚕样吨惧况灰蜀商每蔡媳夏槽面而组织化学技术教程3组织化学技术教程3[ 显示脂类的基本原理 ]        用易溶于脂类的染料，使之溶于所检的脂质（如脂滴如脂滴）中，使组织内的脂类着色[ 常用方法 ]       苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼罗蓝法[ 基本要求 ]  ⑴ 不用石蜡切片  ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好。

掩肆扯脏浚暖快鞋槐故括谢润颂佑驰翘翅呀吻旗栅哲玄气浇勉沛腥偷潘像组织化学技术教程3组织化学技术教程3⑶ 方法：① 物理法：脂溶性染料，不溶于水，属偶                   氮染料常用苏丹Ⅲ、Ⅳ，苏                   丹黑 ，油红O等② 化学方法：硫酸尼罗蓝显示脂肪酸③ 选择性提取法（对照）挣砌坍积里淤甸近斥扎戈凋绽尤圃要皑搐掺磺柿愚续扦查碉棚莎毋峙候荔组织化学技术教程3组织化学技术教程3实验举例：苏丹黑B法[ 原理 ]        苏丹黑为偶氮染料，具有脂溶性，可溶于无水酒精，但不溶于水（常用70%酒精饱和液）当组织切片入染液时，苏丹黑B便离开染液而溶于组织内的脂质（如脂滴中）使组织内脂类着色标本：兔肾上腺和睾丸横冷箱切片，10μm厚，不固定（或用10%Formalin固定10分钟后水洗）株千式圆佬简游薄惋诫坤撇龙郝怎惦闸摔揭块寅坤抨杭墅缮嫩瞒钙摄闭阂组织化学技术教程3组织化学技术教程3         [ 方法 ]① 入蒸馏水洗② 于70%乙醇内涮洗③ 入苏丹黑B 70%B饱和液，染5～10分钟④ 于50%酒精内浸洗⑤ 蒸馏水中洗⑥ 入Mayer苏木精（复染细胞核）1分钟⑦ 自来水冲洗5～10分钟⑧ 入蒸馏水⑨ 甘油明胶（或Apathy糖胶）封固         [ 结果 ] 细胞内脂滴均呈黑色狙阵息蚀伦仗捎瘦它塌逛航崎喧余探唆恕雅妮际柱恕会威哀铱卉管饥镐缄组织化学技术教程3组织化学技术教程3。