植物组织叶绿素的提取及分离.doc

植物组织中叶绿素的提取及分离一、实验目的 1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法； 2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理 二、实验原理 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂 胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯它有三种异构体，即a-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素 叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小 本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过柱层析进行分离。

三、主要仪器与试剂 仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸 试剂：硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60-90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶 四、实验流程五、操作步骤 1、菠菜色素的提取 称取2g洗净后的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与10mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣 将菠菜汁放回研钵，每次用10mL 3:2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用5mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止 2、柱层析 在层析柱中，加3cm高的石油醚另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部将3g层析用的中性氧化铝（150~160目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。

装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下1~2mm高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面） 将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体 待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂—石油醚-丙酮溶液9:1（体积比）打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素 用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素（1）再用丁醇-乙醇-水3:1:1（体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色） 六、注释 （1）叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带 七、思考题 1、试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？ 。