高粘附性乳酸菌的筛选、鉴定及其表面疏水特性研究.pdf

分类号—— UDC ——学号巡! 1 2 丝密级——学位论文高粘附性乳酸菌的筛选、鉴定及其表面疏水特性研究靳彩娟申请学位级别：亟±学科专业名称：盒昌工程论文提交E t 期：2 Q ! 兰生§目论文答辩E t 期：2 Q ! 兰生§月学位授予单位：扬刿一太堂学位授予日期：2 Q1 3 生鱼目答辩委员会主席：．处云教援靳彩娟高粘附性乳酸菌的筛选、鉴定及其表面疏水特性研究l摘要乳酸菌通过粘附于肠道黏膜形成稳定的生物屏障，具有抑制病原菌的入侵和增殖等重要生理功能，因此粘附能力是评价乳酸菌益生特性的重要指标之一研究表明细菌的表面疏水特性不仅与细菌与宿主的粘附，而且与致病菌的清除存在一定的关联，但其相关性尚需要进一步数据证实本研究对4 7 株不同来源的乳酸菌分离株对小鼠巨噬细胞、脾脏细胞、肠上皮细胞以及肠黏液的粘附能力进行了测定，并分析了其中不同粘附能力菌株的表面疏水性、自凝聚、致病菌共凝聚能力以及体外抑菌作用应用生理生化结合1 6 Sr D N A测序对7 株不同粘附能力球菌分离株进行了鉴定，并通过分子指纹图谱对菌株间的分子差异进行鉴别，为高粘附乳酸菌的筛选和应用提供理论依据和菌株资源主要研究结果如下：( 1 ) 分别以小鼠原代巨噬细胞、脾脏细胞、肠上皮细胞和小肠黏液建立了4 种体外粘附模型，分析了4 7 株乳酸菌的粘附能力。

结果显示乳酸菌对不同细胞的粘附具有选择性，4 7 株乳酸菌对巨噬细胞粘附能力( 平均1 9 ．2 个／细胞) 显著高于脾脏细胞( 平均9 ．1个／细胞) 和肠上皮细胞( 平均6 ．2 个／细胞) ( p 0 ．0 5 ) 4 7 株乳酸菌分离株对小鼠肠上皮细胞的粘附指数在0 ．3 至1 7 ．0 个／细胞，粘附平均值为6 ．1 个／细胞，其中1 2 株长杆菌、1 4 株球菌、2 l 株短杆菌对巨噬细胞的粘附平均值分别为5 ．7 、5 ．7 和6 ．7 个／细胞，不同形态分离株之间与粘附能力没有显著相关性表2 - 2 乳酸菌对不同类型细胞的粘附能力测定结果T a b l e2 - 2A d h e s i o na b i l i t yo fL A Bs t r a i n st od i f f e r e n tt y p eo fc e l l s3 0扬州大学硕士学位论文序列菌株形态不同乳酸菌对细胞粘附率( 个／细胞)巨噬细胞脾脏细胞肠上皮细胞21H 6球菌6 ．8 ：t ：1 ．96 ．4 - 4 - 2 ．58 ，8 4 - 3 ．4 +2 2H 7长杆2 5 ．3 + 5 ．2 }2 ．1 士1 ．25 ．2 + 1 ．82 3H P l 3短杆1 9 ．5 士3 ．64 ．3 士1 ．53 ．0 士1 ．72 4P 1 0长杆3 9 ．2 + 8 ．1 +5 ．1 - 4 - 1 ，74 ．3 士1 ．42 5P 2短杆1 9 ．8 士3 ．11 4 ．0 士3 ．2 46 ，7 士2 ．22 6P 5短杆1 7 ．2 - - E 2 ．78 ．7 a ：1 ．71 0 ，o 士3 ．2 +2 7S P l 3短杆1 9 ．o 士3 ．48 ．啦2 ．32 ．6 4 - 1 ．32 8Y 1 4 ．3短杆2 ．0 i l ．25 ．9 - a ：1 ．32 ．7 ：t _ 1 ．02 9Y 1 5 ．2 6短杆1 3 ．I + 4 ．81 1 ．0 - 士3 ．02 ．0 - t - 1 ．03 0Y 2 6 ．5短杆1 5 ．4 ：k 3 ．72 5 ．5 + 3 ．6 +1 2 ．6 ：- ' - 4 ．3 +3 1Y 2 7短杆1 ．5 士1 ．36 ．8 ：t ：1 ．15 ．9 ±1 ．23 2Y 2 7 - - 4球菌2 7 ．4 ：k 4 ．5 }9 ．8 士2 ．16 ．4 士1 ．83 3Y 2 9 - 4长杆4 0 ．1 4 - 5 ．0 +1 8 ．6 士2 ．6 +5 ．2 - + 1 ．83 4Y 3 0球菌4 ．5 ：k 1 ．89 ．3 士3 ．71 ，2 士0 ．93 5Y 3 5 ．3球菌1 3 ．1 4 - 3 ．71 0 ．6 + 3 ．91 2 ．0 士1 ．5 43 6Y 3 6 —3短杆2 9 。

6 4 - 6 - 3 +5 ．1 - 4 - 2 ．46 ．1 士2 33 7Y 4长杆31 ．7 士3 ．5 + 8 ．2 a ．2 ．05 ．2 - + 1 ．73 8Y 4 2 ．1短杆6 ．7 士1 ．94 ．2 士3 ．80 ．3 i - 0 ．03 9Y 4 2 _ 4长杆3 1 ．2 - + 6 ．1 +1 0 ．4 士3 ．06 ．3 士1 ．94 0Y 4 3短杆1 9 ．o 士2 ．36 ．1 4 - 1 7O ．9 a ：1 ．04 1Y 4 ．5长杆3 2 - 士6 ．O + 8 , 4 士2 ．01 4 ．5 - + - 3 ．6 44 2Y 4 5 —3 0球菌2 9 ．6 + 3 ．4 48 7 + 2 ．36 ．9 - 士2 ．74 3Y F l 9短杆1 3 ．1 士3 ．86 ．9 - t 2 ．43 ．2 士1 ．94 4Y F 3 7短杆3 ．2 士1 ．91 0 ．蛀3 51 4 ．0 i 2 ．8 +4 5Y L ．2球菌2 1 ．7 4 - 5 ．01 0 ．3 士2 ．75 ．1 - 4 - 1 ．64 6Y L - 2 2球菌1 2 土1 ．26 ．5 士1T 38 ．o 士3 ．6 +4 7Y S 4 2短杆3 1 ．1 4 - 3 ．3 。

1 0 ．2 ：1 ：2 ．27 ．3 4 - 1 ．3 +4 8甲均值1 9 ．58 ．95 ．7注：- 表示显著高于对应的平均值( p 5 0 ％为高疏水性，C S H ％介于2 0 ％和5 0 ％为中度疏水，C S H ％ 7 ．5 )北京鼎国生物技术有限公司氯仿中国恒利试剂厂( 上海)异戊醇天津市科密欧化学试剂开发中心异丙醇冰乙酸S D S蛋白酶K1 0 ×B u f f e rR N a s eT a q 酶d N T P sD N AM a r k e r过氧化氢注：所用试剂均为分析纯1 ．3 仪器与设备T G l 6 一W S 型台式高速离心机X W - 8 0 C 型漩涡混合器D K ．S 1 2 型电热恒温水浴器S X ．5 0 0 型高压蒸汽灭菌锅D G X 一9 0 5 3 B ．2 型生化培养箱B S Z ．3 型自动双重蒸馏水器Z H J H —C12 0 9 B 型垂直流超净工作台D Y Y - S B 型稳压稳流电泳仪S C ．D 型水平电泳槽紫外凝胶成像系统P T C ．1 0 0 P C R 仪1 ．4 试剂与培养基扬州大学硕士学位论文中国恒利试剂厂( 上海)中国恒利试剂厂( 上海)上海生物工程有限公司德国M e r c k 公司进口上海生物工程有限公司上海生物工程有限公司上海生物工程有限公司上海生物工程有限公司上海生物工程有限公司国药集团化学试剂有限公司湘仪离心机仪器有限公司上海医科大学仪器厂上海森信实验仪器有限公司日本T O M M Y 公司上海福玛实验设备有限公上海博通有限公司上海智诚分析仪器制造有限公司北京市六一仪器厂南京新校园生物技术研究所上海天能科技有限公司美国M J 公司( 1 ) 5 0 0m m o l ／LE D T A ( p h8 ．0 ) ：在8 0m L 水中加入1 8 ．6 lg 乙二胺四乙酸二钠，用N a O H 调( p h8 ．0 ) ，加水定容至1 0 0m L ，灭菌备用。

2 ) 5 0 0m m o l ／L 瓢s - H C L ( p h9 ．0 ) ：在8 0m L 水中加入6 ．0 5 5g 三羟甲基氨基甲烷( ' I r i s ) ，溶解后用稀盐酸调p h9 ．0 ，加水定容至1 0 0m L ，灭菌备用 3 ) T E 缓冲液( p h8 ．0 ) ：在8 0m L 水中加入2m L 5 0 0m m o l ／L “ I r i s - H C L ( p h9 ．0 ) 和0 ．2m L 5 0 0m m o l ／LE D T A ( p h8 ．0 ) ，调p h8 ．0 ，加水定容至1 0 0m L 靳彩娟高粘附性乳酸菌的筛选、鉴定及其表面疏水特性研究5 9( 4 ) 3m o t ／LN a A c ( p h5 ．2 ) ：8 0m L 水中加入2 4 ．6 0g 无水乙酸钠，调p h5 ．2 ，加水定容至1 0 0 m L ，灭菌备用 5 ) 1 0 ％S D S ( p h7 ．2 ) 溶液：9 0m L 水中加入1 0g 电泳级十二烷基磺酸钠( S D S ) ，加热至6 8 ℃助溶，用N a O H 调p h7 ．2 ，加水定容至1 0 0 m L ，灭菌备用。

6 ) C T A B ／N a c l 溶液：在7 0m L 的水中溶解4 ．1g N a c l ，缓慢加入1 0g C T A B ，同时加热并搅拌，如需要可加热至6 5 ℃溶解，定容体积至1 0 0m L 7 ) 5 0 ×T A E 电泳缓冲液：在8 0 m L 水中加入2 4 ．2 9 “ I r i s 碱，5 ．7 1m L 冰乙酸，1 0 m L 5 0 0m m o l ／LE D T A ( p h8 ．O ) ，定容至1 0 0m L 8 ) 溴化乙锭( E B ) 溶液：1 0m g ／m L ，应用浓度0 ．5p e , ／r n L ，4 ℃避光保存 9 ) 6 ×上样缓冲液：溴酚蓝0 ．2 5 ％( w ／v ) 、二甲苯青F F O ．2 5 ％( w ／v ) 、甘油3 0 ％( v ／v ) 、d d H 2 0 水定容至1 0 0m L ，分装于1 ．5m L 指型管，4 C 保存 1 0 ) 耐盐性试验：配制M R S 液体培养基，校正p h7 ．2 ，加入氯化钠，使其含盐量为1 0 ％，灭菌备用( 1 1 ) 葡萄糖产气试验：配制M R S 液体培养基，分装于装有杜氏小管的试管中，灭菌备用。

1 2 ) 动力学试验：配制M R S 液体培养基，加入O ．1 - 0 ．2 ％琼脂粉，加热溶解后分装于试管中，每管培养基高度为4 ．5 ．5c m ，1 2 1 ℃灭菌1 5m i n ，直立凝固备用 1 3 ) 耐酸碱性试验：配制M R S 液体培养基两瓶，一瓶用氢氧化钠将其p h 调为9 ．6 ，另一瓶用盐酸将其p h 调为4 ．5 ，灭菌备用1 ．5 乳酸菌的分子鉴定1 5 ．1 基因组D N A 的制备提取方法参照《精编分子生物学实验指南》【1 2 8 】的C T A B 法，并进行适当改良提取乳酸菌基因组D N A 1 ) 每个离心管倒入1 ．5m L 菌液，1 0 0 0 0r ／m i n 离心5m i n 2 ) 弃上清，加lm L T E 缓冲液，振荡使之充分混匀，1 0 0 0 0r ／m i n 离心5m i n 3 ) 弃上清，加5 6 7p L T E 缓冲液与沉淀物充分混匀，再加入3 0 ／a L1 0 ％S D S 和5p L2 0m e d r n L 蛋白酶K ，轻轻颠倒混匀，放入3 7 ℃烘箱lh 4 ) 加入1 0 0g L5m o l ／L 的N a C l 溶液，轻轻颠倒混匀，再加入8 0g LC T A B ／N a C I溶液，轻轻颠倒混匀；6 5 ℃水浴1 0m i n 。

5 ) 加入8 0 0 ／a L 酚／氯仿／异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，轻轻混匀，1 5 0 0 0r ／r a i n 离心1 5r a i n 扬州大学硕士学位论文( 6 ) 取上清液置对应的新的离心管；再次加入5 0 0p L 酚／氯仿／异戊醇，1 5 0 0 0r ／m i n离心1 5m i n 7 ) 取上。