金线莲组培快繁.docx

金线莲组培快繁技术研究 【摘要】 目的建立金线莲快繁体系方法以茎段为外植体，开 展了茎段不同部位、培养基、激素、有机物和活性炭对不定芽增殖、 幼苗生长的影响研究，并进行了移栽试验结果外植体以不含顶芽和 长根的中间段茎节为好；不定芽增殖最佳培养基配方为MS （或B5） +BA3.0 mg/L+NAA0.5〜1.0 mg/L，两个月增殖倍数达5.0以上；壮 苗最适培养基为1/2MS+NAA3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+香蕉提取 物 20%（或椰子汁 20%）；试管苗移栽适宜的基质为菜园土1 份＋2〜3 mm粗砂2份（或1份）+木屑1份（或2份），3个月成活率均达 100%，且生长良好结论采用上述方法，能实现金线莲幼苗的快速 繁殖关键词】 金线莲； 快速繁殖； 增殖； 生长； 移栽金线莲 Anoectochilus roxburghii（wall.） lindl 为兰科开唇兰属多 年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材， 素有“金草”“神药”“乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛 应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的 治疗 和 强身健体、病后体虚恢复等方面，在浙江、福建、 台湾 等省和东南 亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是备受青睐，被称为“药 中之王”[1 ， 2]。

金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成， 自然 萌 发率和繁殖率低，目前市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处 于供不应求的状况近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入， 对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严 峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于处于濒临灭绝之地本 研究旨在采用组织培养技术，解决金线莲种苗来源，加快人工栽培， 以保护金线莲野生资源、稳定市场供应现将有关实验结果如下1 材料与方法1.1 材料 无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源，其它实 验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段1.2 无菌繁殖体系的建立 取生长健壮、无病虫害的植株，去 叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3〜5 min,然后用流水冲洗30 min在超静工作台前，用75%酒精湿润5〜6 s,放入0.1%的HgCl 溶液灭菌12〜13 min，用无菌水冲洗5〜6次将消毒好的茎按上段 (具茎尖)、中段和下段(匍匐茎段)切成长约1.5〜2 cm,带有1〜 2个节间的小段，分别接种于MS+6-BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L培 养基上，pH5.6,蔗糖2.5%,琼脂0.7%。

培养条件为：温度(25土2) °C , 光照时间12 h/d,光照强度1 500〜2 000 lx1.3 不定芽诱导1.3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响 采用单因素实验,培养 基选用MS (Murashige-Skoog) [3], 1/2MS (大量元素减半，其他成 分不变)，VW(Vacin & Went), B5 (Gamborg • Miller & Ojima)和 KC(Knudson C)等 5 种，分别添加 6-BA 4.0mg/L, NAA 1.0 mg/L1.3.2激素对不定芽诱导的影响以MS为基本培养基，添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素上述实验选取无菌健壮植株，切取长约1~1.5 cm,带有一个节 间的茎中段，每处理接10 个茎节，重复3次培养期间定时观察不 定芽生长情况，培养60 d 后统计不定芽数其它条件同实验“1.2” 项1.4 壮苗培养1.4.1激素对幼苗生长和发根的影响 以1/2MS为基本培养基， NAA 设 1 〜5 mg/L 5 个处理,6—BA 设 0.5, 1.0 和 1.5 mg/L 3 个处理， 共15个处理1.4.2添加物对幼苗生长和发根的影响以1/2MS+NAA 2.0 mg/L +6—BA 0.5 mg/L为基本培养，考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹 果提取物、椰子汁等4种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影 响。

上述每种培养基均接入经增殖培养高约3 cm,具3〜4节间、有 1~2片的无根幼苗，每处理接种接无根幼苗10株，重复3次培养 后每隔15 d观察生长情况1次，至3个月考察每株净增加的叶片数、 重量及发根数，并进行数理统计分析1.5移栽 选苗高约6〜8 cm，茎基直径约2 mm，丛生根有2〜3 条的试管苗，炼苗4 d后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤 水后移人直径为15 cm，装有不同基质的土盆中，考察不同基质对金 线莲试管苗成活率的影响移栽前，实验基质均用 45%多菌灵可湿性 粉剂 800 倍溶液浇透消毒实验条件为遮荫度80%的荫棚，保持空气 相对湿度的80%〜90%如发现有病死植株，及时拔除每处理5盆， 每盆种5株，重复3次，移栽3个月后考察成活株数，并进行数理统 计分析2 结果2.1 无菌繁殖体系的建立 实验表明，外植体茎段的分化程度 对诱导结果存在一定的影响从表1 可知，上、中段茎均能萌动生长 上段茎因有顶芽的存在，顶端优势表现较为强烈，因而以生长为主， 不定芽发生较少，平均芽增殖数为0.6 个；中段茎不定芽发生快、量 大、长势好，平均芽增殖数为 4.05 个，并形成多枝丛生状。

下段茎 由于组织相对老化，虽有不定芽发生，但发生量与生长势均较弱这 和陈自力［4］报道的结果一致从实验中观察到，不定芽的产生以侧芽萌生为主一般在培养15〜20 d后，茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大，芽丛在节的四周萌出， 起初为白色略带黄色，随着培养时间加长，芽不断伸展，逐渐转为黄 绿色，形成主芽叶腋芽是单生的，极个别节上能对生两个腋芽，未 发现茎部或切口处长出不定芽培养30 d 左右，主芽基部的节再生 侧芽（称一级侧芽），45 d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽，随着 芽的生长、出现叶片，节处毛并产生根，外被浓密的白色绒毛，从而 形成完整小植株培养3 个月后每天观察，侧芽分生组织的增殖，一 般只出现主芽和一二级侧芽或苗；培养 5 个月以上，主芽、侧芽较高， 叶片较多、大，只有少数出现三级侧芽或苗这种腋芽萌生的增殖形 成了主轴分枝型的芽苗，随培养时间或继代繁殖代数的增加，或激素 的作用，芽或苗因节间短，多数为形成似不定芽或丛生苗培养过程 中，未见愈伤组织，也没有发现有原球茎和类原球茎产生表 1 金线莲茎段外植体不定芽诱导（略）2.2 不定芽诱导2.2.1 基本培养基对不定芽诱导的影响 以金线莲的茎节段作为 外植体，腋芽能快速萌发出不定芽体。

经 60 d 的培养，增殖倍数可 达3.1〜5.4倍但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响，MS, B5 培养基不定芽增殖率分别为 5.4 倍与 5.2 倍，比其它培养基增加 23.8%〜74.2%表 2 基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响（略）经 LSR 差异显著性测定， MS， B5 培养基之间无明显差异，与1/2MS, KC和VW之间存在极显著差异，且MS, B5培养基上诱导 产生的不定芽色绿、粗壮（见表2），表明 MS， B5 培养基适合作为 金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基［5］2.2.2 激素对不定芽诱导的影响 激素种类、水平与配比对组织培 养快速繁殖在效率存在明显的影响，6-BA、KT和NAA是3种常用 生长调节剂，其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大结果见表 3 从表3可知，同为细胞分裂素的6-BA，KT在相同的添加量下对不定 芽的增殖效果差异极显著,6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%,表明 6-BA 比 KT 更适合金线莲茎节不定芽的诱导6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果在添加量小于4.0 mg/L的 情况下，随浓度的提高，不定芽增殖率明显上升，添加量为4.0 mg/L 的不定芽增殖率比2.0, 1.0 mg/L分别提高22.1%和47.6%。

当6-BA 添加量达到 6.0 mg/L 时，其增殖率还出现下降趋势，表明本实验条 件下6-BA添加的适宜量为4.0 mg/L表 3 激素对金线莲不定芽诱导的影响（略）生长素 NAA 对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进作 用从表3可以看出，添加了 NAA的培养基不定芽增殖量与生长明 显较不添加的好,芽体粗壮、色浓绿,其中添加 0.5 mg/L 的表现最 好，添加 1.0 mg/L 的其次，但二者间差异未达到显著水平；与其它 不添加 NAA 的相比差异达极显著水平表明在本试验条件下 NAA 适宜添加的量为0.5〜1.0 mg/L2.3 壮苗培养2.3.1 激素对幼苗生长的影响 在金线莲壮苗培养中， NAA 较 6-BA对促进幼苗生长的影响更为明显结果见表4NAA浓度低于 3 mg/L 时，对幼苗生长有促进作用，随浓度的增加，叶片净增量、 发根数和鲜重净增量明显增加，当浓度达到4.0 mg/L 时，叶片净增 量、发根数和鲜重净增量增加不明显6-BA在0.5 mg/L情况下，比 不加的具有一定的促进作用，但未达显著水平；在浓度为1.0 mg/L， 1.5 mg/L情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量反而减少，但在 幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生，表明 6-BA 在浓度高于 1.0 mg/L 情况下，有利于金线莲不定芽的生成，对幼苗生长不利。

从表4 也可以看出，处理9、10号在发根数、鲜生净增量方面较 其它处理明显提高，达极显著差异；在叶片净增量方面，除与处理 13、14 号无明显差异外，与其它处理之间的差异达极显著水平，表 明在金线莲壮苗培养中，NAA适宜添加的量为3.0〜4.0 mg/L, 6-BA 添加量为0.5 mg/L或不加表 4 激素对金线莲幼苗生长的影响（略）2.3.2 活性炭与有机添加物对幼苗生长的影响 结果见表 5从表5 可知，不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一，香蕉、椰 子汁对促进幼苗生长最为有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量均 高于其它处理，二者间无明显差异；马铃薯对幼苗生长不利，与其它 处理相比均存在极显著差异水平活性炭对金线莲幼苗生长具有一定 的促进作用，在添加 0.3%情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增 量与对照相比均显著提高，差异达极显著水平；但与香蕉、椰子汁处 理相比，其促进幼苗生长的作用不如前二者，除发根数无差异外，叶 净增量与香蕉、椰子汁处理差异达显著水平，鲜重净增量差异达极显 著水平同时观察到活性炭、香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮试验 结果表明添加 20%香蕉和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长。

表 5 添加物对金线莲幼苗生长的影响（略）2.4 移栽 金线莲试管苗移栽3个月后的植株成活情况见表6 从 表 6 中可以看出，处理 7 和处理 9 保持 100% 的成活率，处理 3 和处 理 8 的植株成活率也在 93%以上，处理 1 的成活率最低，仅为 56% 经LSR差异显著性测定，处理3、7、8、9号之间无明显差异，与处 理 5、 6 号差异达显著水平、与处理1、 2、 4 号差异达极显著水平 表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活 率，适宜添加的比例为1 份菜园土中加入粗砂2 份、木屑1 份或粗砂 1 份、木屑 2 份，要求充分混匀表 6 种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响（略）3 小结金线莲不同部位的茎间对不定芽的诱导结果存在明显的差异，以 不含顶芽和长根的中间段茎节为好，不定芽增殖率达4 倍以上采用金线莲中间茎节作外植体诱导不定芽萌发时，适宜的培养基 为 MS 或 B5 + 6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L〜1.0 mg/L,蔗糖浓度为 2.5%适宜的壮苗培养基为 1/2MS+NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+ 香蕉提取物 。