[精品]细菌鉴定的生理生化反应.docx

细菌的生理生化反应实验组别：周四晚第四组 指导老师：李海花【摘要】各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不i样, 因而代谢产物或多或少地各冇区别，可供鉴别细菌Z用.【关键词】细菌鉴定，生理生化反应，IMVIC,糖发酵，硫化氢，硝酸盐一、实验目的:1. 学习各种生理生化反应实验的原理2. 学习巩固各种主理生化反应实验的接种方式并熟练掌握各种接种方法3. 观察细菌常用生理生化反应实验结果二、实验原理:由于各种微生物具冇不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用 相同的底物但产牛的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不 同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位具 体的原理如下： 鉴定上尤为重要绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解 糖类物质的能力上有很大的差开有些细菌能分解某种糖产牛有机酸（如乳酸、 醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等）；产酸后澳甲酚紫指示剂 可曲紫色pH（6.8）变为黄色（pH5.2）,产气的细菌可使半固体培养基中存冇气泡.1 •糖发?试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的2. IMVIC实验：主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。

1）卩引味试验：在蛋白淼培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋口豚中的色氨酸 分解为内酮酸和U引味，眄I卩朵与对二甲基苯甲醛反应牛成玫瑰色的玫瑰眄I2） V.P.反应和甲基红试验：V.P.反应：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱竣通 过缩合和脱竣后转变成乙酰甲基甲醇（亦称三轻基丁酮），然后被还 原为2, 3-T二醇，乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被空气中的氧气 氧化成为二乙酰，二乙酰再与蛋白月东中的精氨酸的弧基起作用生成红 色化合物在试管中加入a ■蔡酚时，可促进反应进行甲基红反应：某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮 酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等有机酸的产生可由加入甲基红指 示剂的变色进行检测甲基红变色范围为pH4. 2 （红）〜6. 3 （黄） 细菌分解葡萄糖产酸，将培养液由原來的橘黄色变为红色3）柠檬酸盐实验:肠朴菌科各屈细菌利用柠檬酸的能力不同，冇的菌可利用柠檬酸钠作为碳源，有的则不能某些菌分解柠檬酸形成C02、由于培养基中钠 离子的存在而形成碳酸钠，使培养基碱性增加，根据培养基中的指示剂变色情况来判断试验结果指示剂可用1 %的混麝香草酚蓝酒精溶液， 变色范围为pH6.3 （黄）〜7. 6 （蓝）•3. 硫化氢产生实验某些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇重金属盐如铅盐、铁盐吋 则生成黑色硫化铅或硫化铁沉淀，从而可确定硫化氮的产生。

在培养基中加入柠檬酸铁钱或醋酸铅，培养后观察是否有黑色沉淀产生培养基中加入硫代硫酸钠 是为了保持低的氧化还原电位，防止产生的硫化氢被空气中的氧氧化，采用同体穿 刺接种也是为了更好的保持低的氧化还原电位.4. 硝酸盐还原实验某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨和氮气等如果细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，当培养基中加入格利斯亚硝酸试剂时，则 培养液呈粉红色或红色，为正反应如果在培养液中加入格利斯亚硝酸试剂后溶液不出现红色，则有两种可能性:1）细菌不能还原硝酸盐，故培养后的培养液中仍有硝酸盐存在，此为负反应2）硝酸盐被细菌还原为亚硝酸盐后，亚硝酸盐继续被还原成氨和氮气，故 培养液中也没有硝酸盐存在，此反应为正反应培养液中硝酸盐存在与否可用下列方法检查：在培养液中加入二笨胺试剂, 如溶液呈蓝色，则说明原来的硝酸盐未被还原，此系负反应但如果在培养液中 加入二苯胺试剂，溶液不呈现蓝色，则说明培养液中己不存在硝酸盐，故为正反 应三、实验材料1. 培养基：生理生化反应用的各种平板，斜面，液体，半固体培养基.2. 器材：试管架，酒精灯，火柴，接种环（针），牛皮纸，记号笔等.3. 试剂：卬基红试剂、VP试剂、KOH试剂、卿味试剂、格里斯试剂A、B点滴板、二苯胺试剂4. 菌种：大肠杆菌，产气杆菌，变形杆菌!1!实验步骤:1、制备培养基（本组制备柠椽酸盐培养基）1) 培养基的配方：NH4H2PO4 0.2gK2HPO4 0.2 g柠檬酸钠 0.4 gMgSC)4 40mgNaCl 0」g1%麝香草酚蓝酒精液 2ml琼脂 4.0g口来水 200 mLpH 6.82）操作流程：称量…溶解…调pH值…加溟麝香草酚蓝指示剂…分装大试管30支（每 支7ml）…盖帽…包扎…待灭菌（⑵C,20分钟）…灭菌后摆斜面*培养基的pH值是关键，调节pH时要耐心小心2、接种培养*按下表接种并做好标记实验名称培养基接种方式菌种糖发酵糖发酵培养基液体接种大肠杆菌，变形杆菌柠檬酸盐利用柠檬酸盐培养基斜面划线大肠杆菌，产气杆菌硫化氢产生实验醋酸铅培养基穿刺接种大肠杆菌，变形杆菌口弭朵产生实验蛋白月东水培养基液体接种大肠杆菌，产气杆菌甲基红和伏普实验衙萄糖蛋白腺水培养基液体接种大肠杆菌，产气杆菌硝酸盐还原实验硝酸盐还原实验培养基液体接种大肠杆菌，产气杆菌将接种好的培养基放在37C培养箱中培养48h,周六中午观察3、后续反应操作及观察1） 葡萄糖发酵实验：直接观察试管，试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌，不变者为 阴性菌.2） 乳糖发酵实验：直接观察试管，试管变黄者为乳糖发酵阳性菌,不变者为阴性 菌3） 卩引味试验：向培养后的培养基中加入3・4滴乙瞇，摇匀后静置，待乙瞇上升 后，加入2滴卩引味试剂，观察乙瞇和培养物之间是否产生红色4） 甲基红试验：向培养后的培养基中加入甲基红试剂2滴5） 伏■普试验：向培养后的培养基中加入5・10滴40%KOH,加等量的5%a ■蔡 酚，用力摇荡，置37C中30min6） 硝酸盐还原试验：取点滴板，各加入培养液少许，加入格A、格B各5滴， 观察有无红色出现；如出现红色则为正反应。

如不出现红色，则加入二苯胺 试剂，观察有无蓝黑色如出现蓝黑色，则为负反应，否则为正反应7） 柠檬酸盐实验：直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变 者为阴性菌.8） 硫化氢产生实验：直接观察培养好的培养基，出现黑色沉淀者为阳性菌，不 变者为阴性菌五、实验现象:1.葡萄糖发酵犬肠杆菌的培养 基变黄且产气；变 形杆菌的培养基 变黄口产气2.乳糖发酵人肠杆菌的培养 基变咖啡色且产 少量气;变形杆菌 的培养基无变化3.硫化氢产生试 验：大肠杆菌和 变形杆菌穿刺 均变黑4』引喙试验： 大肠杆菌的培 养基变红，产 气杆菌无变化5•柠檬酸盐试验： 大肠杆菌和产气 杆菌的培养基均 生长大量细菌，培 养基变色不明显7.甲基红试验：大 肠杆菌的培养基 变红；产气杆菌 的培养基变黄6 •伏■普试验: 大肠杆菌的 培养基产生 明显菌落，培 养基仍为澄 清8.硝酸盐述原 试验：接有大肠 杆菌的培养液 使格AB混合 液变红；接有产 气杆菌的培养 液不使格AB 混合液变色六、实验结果菌名IMVIC试验硝酸银试验町1味试验甲基红试验伏普试验柠檬酸盐试验（X）大肠杆菌++-++产气肠杆菌--+■■菌名糖发酵试验硫化氢产生试验（X）葡萄糖发酵乳糖发酵大肠杆菌+++变形杆菌++七、讨论1. 实验结果与理论结果有两处不相符1） 硫化氢产生试验中，变形杆菌能分解含硫的有机物产牛硫化氢，而大肠杆菌不能，所以应该是大肠杆菌为阴性现象，即培养基不变黑，变形杆 菌为阳性，培养基变黑。

而实验现象显示两者均变黑分析原因如下：其一可能是接种时谋将两培养基均接为变形杆菌；其二 推测大肠杆菌可能产生了变异2） 柠檬酸盐试验中，产气杆菌能分解培养基中的柠檬酸盐产生碱性化合物,使培养基颜色变深蓝，反应现象呈阳性；反之，大肠呈阴性而实验显 示现象与理论结果恰好相反分析原因如2其一是接种后标记时将两种菌颠倒；其二推测大肠杆菌 产生变异；其三接种环太热将产气杆菌烫死，故培养基不变深蓝2. 实验中注意的问题及经验总结1） 接种环接种吋一定注意把握环的温度，切勿将菌种烫死2） 操作时保持头脑清晰，时刻谨记无菌操作3） 实验小小组成员分工合作、切忌慌乱。