限制性核酸内切酶切割原理方法结果及应用.pptx

PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓 限制性核酸内切酶切割原理、 方法、结结果分析及应应用 课堂内容回顾： 1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶 2、分类： （根据酶的基因、蛋（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅白质结果、依赖的辅 助因子及助因子及DNADNA裂解的裂解的 特异性，将限制性内特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）切酶分为三种类型） Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割 DNA Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异 位点识别和切割DNA双链，所 以通常所说的限制 性内切酶就指这一类酶 Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切 割位点很难预测 { Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别 和切割DNA双链，所 以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶 Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测 3、命名： 规则规则 ： 第一个字母（大写）：取自该该酶的细细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细该细 胞的种名 第四个字母（罗马罗马 数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编编号 例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等 限制性核酸内切酶切割原理 1、Ⅰ类类和Ⅲ类类酶： 在同一蛋白质质分子中兼有切割和修饰饰（甲基化）作用且依赖赖于 ATP的存在。

Ⅰ类类酶结结合于识别识别 位点并随机的切割识别识别 位点不远处远处 的 DNA，而Ⅲ类类酶在识别识别 位点上切割DNA分子，然后从底物上解离 2、Ⅱ类类由两种酶组组成： 一种为为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为为独立的甲基化酶，它修饰饰同一识别识别 序列Ⅱ类类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应应用，它们们是 重组组DNA的基础础绝绝大多数Ⅱ类类限制酶识别长识别长 度为为4至6个核苷酸的回 文对对称特异核苷酸序列，产产生5'或3'黏性末端（也有一些产产生平端或钝钝 端） 几种限制性内切酶的切割位点 例如： 3、同工异源酶：来源不同但能识别识别 和切割同一位 点的酶如：BamHⅠ和BstⅠ，XhoⅠ和Pae R7 等可以相互代替使用 4、同尾酶：识别识别 序列不同，但产产生相同末端的限 制性内切酶如：BamHⅠ和Sau3AⅠ等由此产产生 的DNA片段可借黏性末端相互连连接，操作是具有更 大的灵活性 通过 使 用 (15 种 )限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组 质粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切 酶酶切图谱 分析的方法o 方法： 1.质质粒的构建 采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出 MLCKcDNA 片段，插入质粒 pBKrsv中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质 粒 2.酶切、构建、片段的纯纯化和连连接 按Maniatis等方法进行。

3.重组质组质 粒的转转化 转化采用“热休克”法 4.重组质组质 粒的提取 挑取阳性克隆，在LB培养基中培养，采用碱裂解法提取重 组质 粒 5.定量 取5μLDNA溶液用4.5μl去离子水稀释，用紫外分光光度计比色，读 取AZ60和AZ80吸光度值，计算出AZ60/AZ80比值，按下列公式计算质粒DNA浓度 ,本实验 中质粒DNA浓度为1.0g/L 质粒 DNA 浓度(g/L)=AZ60X稀释度/Z0=AZ60X5 6.重组质粒的限制性核酸内切酶酶切 取0.5ml离心管15只，分别加入质粒 2μl(2μg)，依 次 加 入 限 制性内 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、 PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 应的 NEBuffer2μL、 BSAμL、去离子水 13.5μL、 混匀、点动离心，37 ℃ 水浴孵育2小时 7、配置1.5％的琼脂糖凝胶 称取琼脂糖0.6g,加入 1XTAE 缓 冲 液 40 ml置 微 波 炉 中,中 火120s，熔化后冷却至60℃，加入3μL10g/l溴化乙锭，混匀，倒入插好梳子的模具中 ，凝固后放入电泳槽中。

电泳槽中加入1×TAE缓冲液 8、电泳 取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可 观察到橘红色DNA条带，结果如图 Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit. 结果 重组质粒pBKrsv-MLCK 全长7378bp，通过 DNAstar软件分析获得各酶酶切位点的信息， 选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质 粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点，计 算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切 酶酶切后，获得不同大小的片段，经电泳分析 与理论设计完全一致 结果分析 限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得 的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在选 择限制性内切酶时,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒 序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,这样可保证酶切片段大小能满 足进一步分析的需要 在进行限制性内切酶实验时首先应进行 DNA的定量，1 U 酶的限制性 内切酶活性指在一定时间内(60min)~适当温度下和建议使用的缓冲液中, 在50μl反应体系中,将1μg底物 DNA 完全消化所需要的酶量l单位活性依 所用底物的不同而不同,使用其他底物时,应根据情况确定所用酶量l根 据本实验室的经验,1μg底物 DNA 加入 5 U 的限制性内切酶在2h时间内可 以酶切完全，通常延长消化。

实验实验 中可能出现现的 问题问题 及其讨论讨论 解决方法 1.标准底物检测 酶活性 2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 3.检查 反应系统是否最佳 4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解， 重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细 菌菌株 5.换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩 增 6.将DNA底物与λDNA混匀进行切割验证 7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行 验证 一.如果DNA完全没有被内切 酶切割？ 1.内切酶失活 2.DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDAT等内切酶抑制因子 3.条件不适（试剂 、温度） 4.DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 5.DNA酶切位点没有甲基化( 如Dpn1) 6.DNA位点上存在其它修饰 7.DNA不存在该酶识别顺 序 解决方法 二.如果DNA切割不完全？ 1.内切酶活性下降 2.内切酶稀释方法不正确 3.DNA不纯，反应条件不佳 4.内切酶识别 的DNA位点上的碱基被甲基化或存 在其它修饰 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.内切酶溶液粘度大，取样不准 7.酶切后DNA粘性末端退火 8.由于反应溶液、温度使内切酶变性 9.过度稀释使酶活性降低 10.反应条件不适 11.识别 位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺 序 1.用5-10倍量过量消化 2.用酶贮藏液或反应缓 冲液稀释酶 3.同上 4.同上 5.反应前离心数秒 6.将内切酶稀释，增大取样体积 7.电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取 出后置冰浴骤冷 8.使用标准反应缓 冲液及温度 9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10.使用最佳反应体系 11.加大酶量5-10倍 1.用λDNA作底物检查 酶切结果 2.电泳检查 DNA，换用其它酶切， 纯化DNA片段 三.如果DNA片段数目 多于理论值论值 ？ 1.其它内切酶污染 2.底物中含其它DNA杂质 解决方法 限制性核酸内切酶的 应应用 l用于DNA基因组物理图谱 的组 建 l基因的定位和基因分离 lDNA分子碱基序列分析 l比较相关的DNA分子和遗传 工程 u 将水稻叶绿体的DNA，用EcoR1限制性核酸内切酶消化后， 放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中做电泳分 离。

从LMP中分离出分子大小为1.8-2.5kb之间的DNA片段，再与 同样经过EcoR1限制性核制性内切酶切割并用碱性磷酸酶做了脱 磷酸化处理的pBR322质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆菌 5346菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成Ampr转化子菌落 群体这样就构成了由EcoR 限制性核酸内切酶切割的水稻DNA 基因组库用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的psbA DNA探针 做菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体从这些阳性克隆 体中分离出来的重组体质粒DNA，经进一步的分析，就能测出水 稻叶绿体基因psbA的序列 应用一 应用二 u 利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一个 经常提到的应用例子其过程和水稻叶绿体基因重组大 同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外 ，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分 ）插在抑生长激素基因的旁边由于有了lac操作子的 控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了 。