慢病毒颗粒RNA提取试剂盒.pdf

研究用 说明书 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 Code No. 9766 v201401Da 目 录 内 容 页 码 ● 制品说明 1 ● 制品内容 1 ● 保存与运输 1 ● 实验前的准备 1 ● 操作方法 2 ● 实验例 3 ● 注意事项 4 ● 实验材料最大起始量 4 ● Q&A 4 ● 制品说明 本试剂盒是专门用于从血浆、 全血 、无细胞体液 、 病毒原液 和感染病毒的组织 中提取各种病毒（ Virus）RNA/DNA 的小量纯化试剂盒试剂盒采用了独特的病毒裂解系统，由病毒裂解液裂解病毒释放 RNA 或DNA，再结合核酸制备膜 技术纯化 RNA 或 DNA，适用于各种 RNA 或 DNA 病毒的核酸提取本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，病毒裂解后，提取操作仅需 20 分钟便可完成 本试剂盒 配有 Carrier RNA可提取样品中微量 的 RNA/DNA使用本试剂盒可 从低至 1.0E+04 copies 的甲肝病毒 或 1.6E+05 copies的 flury 株狂犬病毒 中提取得到 RNA，所得 RNA 可通过 RT-PCR 进行检测 。

提取得到的 RNA 可用于RT-PCR 反应、 Northern 杂交等多种分子生物学实验 ● 制品内容（ 50 次量） 本试剂盒分 Part I 和 Part II 两部分 ■ Part I 部分 （ -20℃保存） Proteinase K（ 20 mg/ml） 1 ml Carrier RNA 50 μl ■ Part II 部分（请于室温 15~25℃保存） Buffer VGB*1 12 ml Buffer RWA*1 28 ml Buffer RWB*2 24 ml RNase free dH2O 2 ml×2 Spin Columns 50 支 Collection tubes 50 支 RNase free collection tubes (1.5 ml) 50 支 *1 含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。

若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理 *2 在首次使用前 ，请添加 56 ml 的 100%乙醇，混合均匀 【试剂盒之外所需准备试剂】 ◆ 无水乙醇 ◆ PBS 溶液 ● 保存与运输 1. 本试剂盒分两部分保存， Part I 请保存在 -20℃； Part II 在室温下（ 15-25℃）保存 2. 本试剂盒分两部分运输， Part I 请在 -20℃条件下运输； Part II 于室温下（ 15-25℃）运输 ● 实验前的准备 1. 准备 56℃水浴 2. Buffer RWB 在首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇，混合均匀 3. 洗脱制备膜上的 RNA 时， 请使用 RNase free dH2O -1- ● 操作方法 操作流程见图 1， 分为病毒裂解、 RNA 或 DNA 与膜结合、 RNA或 DNA 纯化等步骤， 病毒 裂解后 的 操作约需 20 分钟（如果 起始材料为感染病毒的组织则需要经过液氮研磨 ），详细说明如下： 1. 病毒 的裂解： 使用不同的实验材料需采用不同的裂解步骤，具体说明如下： ◆ 血浆、血清、无细胞体液 、 病毒原液 中病毒 的裂解： ① 取 10～ 200 μl 的 血浆、血清、无细胞体液 、 病毒原液 ，10~100 μl 的全血， 如果起始量不足 200 μl，用 PBS 溶液或 RNase free dH2O 补足至 200 μl。

② 加入 200 μl 的 Buffer VGB、 20 μl 的 Proteinase K 和 1.0 μl的 Carrier RNA， 充分混匀 于 56℃水浴 温浴 10 分钟 ③ 向裂解液中加入 200 μl 无水 乙醇 ，充分 吸打 混匀 ◆ 感染病毒的组织的裂解 ： ① 取 10 mg 感染病毒的组织 进行液氮研磨，研磨后的组织加入200 μl PBS 溶液或 RNase free dH2O ② 加入 200 μl 的 Buffer VGB、 20 μl 的 Proteinase K 和 1.0 μl的 Carrier RNA，充分混匀于 56℃水浴温浴 10 分钟 ③ 向裂解液中加入 200 μl 无水 乙醇，充分吸打混匀 2. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上 ， 溶液移至 Spin Column 中， 12,000 rpm 离心 2 分钟，弃滤液 3. 将 500 μl 的 Buffer RWA 加入至 Spin Column 中， 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液 4. 将 700 μl 的 Buffer RWB 加入至 Spin Column 中， 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。

注）请确认 Buffer RWB 中已经加入了指定体积的 100%乙醇 请沿 Spin Column 管壁四周加入 Buffer RWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份 5. 重复操作步骤 4 6. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上， 12,000 rpm 离心 2 分钟 7. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml RNase free collection tube 上，在 Spin Column 膜的中央处加入 30～ 50 μl 的RNase free dH2O，室温静置 5 分钟 注） 洗脱制备膜上的 RNA 时，请使用 RNase free dH2O 8. 12, 000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA/RNA 如需获得更大收量，可将离下液重新加入到 Spin Column 膜的中央或再加入 30～ 50 μl 的 RNase free dH2O，室温静置 5 分钟后， 12, 000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA/RNA 9. DNA/RNA 检测 由于提取时加入了 Carrier RNA，不能通过电泳或吸光度测定 定量。

可进行 PCR、 RT-PCR、 qPCR 检测 -2- 图 1. 操作流程简图 直接裂解或液氮研磨 加 Buffer VGB、 Proteinase K和 Carrier RNA 56℃温浴 裂解液 向裂解液中加无水乙醇 溶液移至 Spin Column 中 弃滤液 Buffer RWA Buffer RWB 弃滤液 Spin Column 移至 1.5 ml RNase free tube 上 RNase free dH2O RNA 或 DNA 溶液 实验材料 清洗 Spin Column ● 实验例 1. 从 甲肝疫苗原液中提取 HAV RNA 并进行 RT-PCR 检测 的实验例 使用本试剂盒从 1 μl、 0.1 μl、 0.01 μl 甲肝疫苗原液 (分别相当于 6.0E+06、 6.0E+05、 6.0E+04 copies的 HAV)中提取 其 RNA，并 使用 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV) (Code No. RR024)进行RT-PCR 检测， 扩增 289 bp 片段， 电泳结果见图 2 M 1 2 3 + - M 1% Agarose 凝胶电泳图 M ： 100 bp DNA Ladder（ Dye Plus） 1 ： 6.0E+06 HAV 检测结果 2 ： 6.0E+05 HAV 检测结果 3 ： 6.0E+04 HAV 检测结果 +/- ： 正负对照 (Code No. RR024) 图 2. 从甲肝疫苗原液中提取 HAV RNA 并进行 RT-PCR 检测 2. 从 HL60 细胞培养液、全血、唾液、尿液、小鼠肝脏中提取 HAV 病毒 RNA，并进行 RT-PCR 检测 的实验例 使用本试剂盒 从 200 μl 培养细胞（ HL60）、 10 μl 全血、 200 μl 唾液、 200 μl 尿液、 10 mg 小鼠肝脏中提取 HAV RNA，并 使用 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV) (Code No. RR024)进行 RT-PCR 得到 289 bp 片段， 其电泳结果见图 3。

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 + - M 1% Agarose 凝胶电泳图 M： 100 bp DNA Ladder（ Dye Plus） 1.2： HL60 细胞培养液中 HAV 检测结果 3.4：全血中 HAV 检测结果 5.6：唾液中 HAV 检测结果 7.8：尿液中 HAV 检测结果 9：小鼠肝脏中 HAV 检测结果 +/-：正负对照 (Code No. RR024) 图 3. 从 HL60 细胞培养液、全血、唾液、尿液、小鼠肝脏中提 取 HAV 病毒 RNA， 并进行 RT-PCR 检测的实验例 3. 从 狂犬疫苗 Flury 株中提取 RNA 并 进行 RT-PCR 检测 的实验例 使用本试剂盒从 10 μl 和 0.1 μl 狂犬疫苗 Flury 株原液中提取 RNA，并 使用 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV) (Code No. RR024)进行 RT-PCR 得到 500 bp 片段， 检出感度分别为 1.6E+07 copies和 1.6E+05 copies， 其电泳结果见图 4。

M 1 2 1% Agarose 凝胶电泳图 M： DL2,000 DNA Marker 1： 1.6E+07 copies 狂犬疫苗 Flury 株检测结果 2： 1.6E+05 copies 狂犬疫苗 Flury 株检测结果 图 4. 从狂犬疫苗 Flury 株中提取 RNA 并 进行 RT-PCR 检测的实验例 -3- ● 注意事项 1. 应尽量使用新鲜的实验材料，以确保 样品中的 RNA 不被降解 2. 使用液氮研磨组织材料时，应随时加入液氮，以确保提取的 RNA 不被降解 3. 部分试剂中含刺激性化合物，操作时请戴上乳胶手套和眼镜，避免沾 染皮肤和眼睛等，并应尽量在通风橱中进行操作若沾染皮肤、眼睛，要立即用大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询 4. 建议用 RNase free dH2O 洗脱 5. 由于试剂盒使用的 Carrier RNA 是 大肠杆菌 来源的 RNA，其主要作用是提高微量 DNA/RNA 提取时的回收率，并保护提取得到的微量 RNA 不被降解但一旦待检样品引物与 Carrier RNA 同源性较高时，偶尔会产生假阳性检出（假阳性判断标准：不添加检测样品，使用 dH2O 替代样品提取核酸后，经过PCR 反应也得到明显扩增）。

如果产生假阳性检出时，可重新设计引物， 或选择不使用 Carrier RNA，不使用 Carrier RNA 时 ， 微量 DNA/RNA 的收率会有所降低，导致病毒的检出感度会略有下降。