信号肽在基因工程的应用.ppt

信号肽在基因工程的应用主讲人：钟鸣 成员：黄玲信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（ 定位）的N-末端的氨基酸序列有时不一定在N- 末端）信号肽位于分泌蛋白的N端一般由15～30个氨基 酸组成包括三个区：一个带正电 的N末端，称为 碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸 为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主 要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分 子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区 v信号肽的结构特点 前端（Ns端）：介于-1～+5之间，均带正电荷的碱性aa残基 作用：可能和信号肽序列受体（SSR）结合有关中部(Hs区域) ：12～14个aa残基组成疏水片段Met .Leu.Phe 作用：1）高度疏水，倾向于α—螺旋有利于与脂质双层作用，促进新 生肽链过膜 2）Hs与信号序列识别颗粒（SRP）结合有关 (SPR将新生肽链核糖体和RER膜靠近)后端（Cs1,Cs2）：富含A/a，易形成β—折叠，有利于肽链 断裂 作用：是位于RER膜上的信号肽酶复合物（SPC）水解部位，切 除信号肽，使新生肽链也能进入RER注意：1）信号肽的疏水片段较重要，因为如果利用 点突变将其中心的疏水aa换成亲水aa，信号 肽的功能丧失。

2）信号肽不一定位于分泌蛋白的N端 例如：真核细胞的卵清蛋白N端26～45个aa 可能具有信号肽作用，这样的信号肽称为内 含信号肽 3）有些比较复杂的膜蛋白（如视蛋白Opsin ）可以含有一个以上的信号肽，这些信号肽 不一定会被水解 信号肽分泌蛋白的转运过程分泌型表达载体信号肽ATG信号序列插入位点终终止子分泌型表达载体——原核原核常用的信号肽：碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽pTA1529----phoA (碱性磷酸酶)pINⅢ系统---- ompa（外膜蛋白)PEZZ18----蛋白ApTA1529大肠杆菌phoA（碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达由周质信号肽酶切下信号肽pINIII系统D下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解 pINIII-A1：plasmid ds-DNA 7400 BPpINIII-A2：plasmid ds-DNA 8900 BPpINIII-A3：plasmid ds-DNA 7400 BPIpp（脂蛋白基因）启动子Tac启动子 ：IPTG诱导转录信号肽序列：大肠杆菌中分泌蛋白外膜蛋白(ompa) ；EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠlac阻遏子的基因（lacI）pEZZ18Plac：Lac启动子Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动子S：蛋白A的信号肽序列两个合成的Z功能域（结合lgG ，琼脂糖层析柱）2分泌型表达载体——真核酵母常用 信号肽序列：α因子、酸性磷酸酶（PHO5)、蔗糖酶（SUC2）等的信号肽。

α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽及后面的一段由Lys-Arg(Glu-Ala)l-2或Lys-Arg-Glu-Ala-Asp-Ala氨基酸序列组成的问隔肽膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别Lys-Arg C端，STEl3基因产物则识别(Glu-Ala)l一2或Asp-Ala外侧常用的分泌表达载体有：pPIC9K、pPICZα、pGAPZα系列——α因子分泌型表达载体——真核Zeocin:博莱霉素MCSPGAP甘油醛三磷酸脱氢酶启动子：组成型表达启动子MCSS新型毕赤酵母分泌表达载体的构 建与功能验证pPIC9上的甲醇 诱导型启动子AOX组成型启动子 GAP启动子毕赤酵母表达载体pGAPHα的构建毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2的构建a—Factor信号肽克鲁维酵母菊粉酶基因 信号肽INU毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建vBglⅡ酶切构建好的2 种新型毕赤酵母表达载体 pGAPHα- xyn2和 pGAPHI-xyn2，使质粒线性化，电击法转化毕赤 酵母 GS115 ，筛选转化子在 培养基中震荡培养48 h ，离 心取上上 清液，测定木聚糖酶活性，以毕赤酵母诱导型表达 载体pPIC9-xyn2为对照，实验结果如表：2融合gp67 信号肽的慈菇蛋白酶抑制 剂基因在蚕体内表达1.重组转移载体 pBacPAK-gpAPI2 的构建pBacPAK-gpAPI2 的 ph. p、gp67 信号肽序列和 A PI2 基因的连接处序列为:2.重组病毒的筛选及表达产物分子量测定3.血淋巴中表达产物含量的测定表达产物经 SDS-PAGE电泳 ,脱色后用凝胶干燥 仪干燥 ,用Bio-Rad GS-670 图像分析仪进行扫描处 理。

测得 CrBK-API4 感染的血淋巴上清液中表达的 API占可溶性蛋白含量的 9 %,CrBK-gpAPI2 感染的 血淋巴上清液中表达的 API占可溶性蛋白含量的 7 %血淋巴中可溶性蛋白总量测定表明:CrBK-API4 感染的血淋巴上清液中为 40mg/ mL ,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴上清液中为 55mg/ mL从而得到血 淋巴中表达的慈菇蛋白酶抑制剂的绝对含量:CrBK- API4 感染的血淋巴中为 3.6mg/ mL ,CrBK-gpAPI2 感 染的血淋巴中为3.8mg/ mL两者的绝对表达量差 别不大4 . 表达的慈菇蛋白酶抑制剂的活性测定水稻条纹病毒CP与叶绿体 Rubisco SSU 引导肽融 合 基因的构建及其原核表达 方法 1.叶片总 RNA 的提取 2. PCR 扩增 Rubisco SSU和 RSV CP 基因 3. pMD-R 和 pMD- CP 克隆载体的构建 4. pGEX- PR 和 pET- PR-S 表达载体的构建5. PR- CP 和 PR- S-CP 融合基因的构建 6.融合基因在大肠杆菌中的表达7.表达产物的 Western blot 鉴定 参考资料：融合gp67 信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内 表达。

季 平,肖庆利 ,何家禄 ,吕鸿声,吴祥甫水稻条纹病毒 CP 与叶绿体 Rubisco SSU引导肽融 合基因的构建及其原核表达 鹿连明， 林丽明， 谢荔岩， 林奇英， 吴祖建 谢联 辉 新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证宋庆凤，暴立娟，李 杰。