隐球菌脑膜炎小鼠脑组织cd44表达,.doc

印度至诚大药房 c6j 编辑隐球菌脑膜炎小鼠脑组织隐球菌脑膜炎小鼠脑组织 CD44 表达表达,背景：新生隐球菌是一种严重危害人类健康的医学真菌,隐球菌病发病率逐年增加,其中 90%侵 犯中枢神经系统,引起致命性的脑膜脑炎新生隐球菌侵犯中枢神经系统的机制和治疗的研 究受到高度重视隐球菌感染中枢神经系统的前提是必须通过血脑屏障目前,国内外学者 围绕隐球菌与脑血管内皮细胞相互作用方面做了大量的研究,发现了隐球菌通过胞吞胞吐等 方式穿越脑血管内皮细胞最新的研究显示,在隐球菌感染脑血管内皮细胞过程中,菌体荚膜 透明质酸 HA 与宿主 CD44 相互作用,促进隐球菌侵袭宿主细胞和细胞骨架重组易于菌体 穿越脑血管内皮细胞CD44 在隐球菌感染宿主过程中发挥重要作用研究发现,CD44 是分 布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白,属于未分类的粘附分子CD44 作为细胞表面的黏着性 受体,与许多疾病的进展和转归都有密切的关系,甚至能成为多种疾病治疗的靶点目前,国 内外学者研究隐球菌穿越血脑屏障感染中枢神经系统的机制主要集中在细胞水平上,在动物 模型上的研究报道较少本研究组已经成功建立隐球菌脑膜炎小鼠模型在此基础上,已经 开展了多项关于隐球菌脑膜炎的发病机制的课题研究,分析了新生隐球菌中枢神经系统感染 动物模型脑组织含水量的变化规律。

发现 AQP4 蛋白在调节隐球菌脑膜炎脑内水液平衡中 发挥重要作用为进一步研究探索隐球菌脑膜炎的发病机制打下良好的基础我们拟在动 物模型上研究隐球菌与小鼠作用前后 CD44 的表达变化,阐明 CD44 是隐球菌脑膜炎发生的 重要分子利用现代分子生物学技术在分子水平上研究隐球菌与宿主的相互作用已经非常 成熟我们应用 RT-PCR 技术、Western-blotting 技术和免疫组化技术检测隐球菌脑膜炎小 鼠脑组织 CD44 表达,阐明小鼠脑组织 CD44 表达与隐球菌脑膜炎发病的相互联系,说明 CD44 在隐球菌脑膜炎的发病中发挥重要作用探索和阐明隐球菌脑膜炎的可能的发病机制,为本 病的预防和治疗指明新的方向目的：1、应用RT-PCR 技术、Western blotting 和免疫组化技术测定隐球菌脑膜炎小鼠脑 组织中 CD44 表达；2、阐明 CD44 与隐球菌脑膜炎发生的关系,探索隐球菌脑膜炎可能的发 病机制方法：第一部分：1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织标本从-70℃冰箱取出备用2、将 各组组织转移至 12×55mmm 试管中,匀浆后,经异丙醇,75%乙醇,20ulDEPC 处理水处理,抽提 组织 RNA。

3、将经过稀释后的 RNA 样本,加入逆转录酶 MMLV 1ul, oligo (d T 0.5 ul, dNTPs 0.5ul,5×逆转录 buffer 4ul, DEPC 处理水 10ul 反应,制备逆转录 cDNA4、将制备好 cDNA 2ul 加入 SYBRGreen Mix 32.5ul,上游引物 F 0.5ul,下游引物 R 0.5ul, ddH2O 水 14.5ul,进行 PCR 扩增 第二部分：1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织标本从-70℃冰箱取出备用2、将称取各样本冰浴 条件下匀浆；13200rpm 离心,取上清液,-80℃保存3、样品采用 10 倍稀释,求得在 20μl 总 体积中的样品体积,每个样品上样量为 40μg4、将分装好的样品经过 SDS-PAGE 电泳、转 膜及封闭、然后加入一抗和二抗作用、ECL 显色后,放入定影液显影定影检测脑 CD44 的 表达第三部分：1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织标本及正常小鼠脑组织从-70℃冰箱取出备 用2、免疫组化染色：将各组标本取出制作石蜡切片,常规脱蜡脱水,加入一抗和二抗以及 显色液,进行免疫组织化学显色3、封片后镜下观察切片结果,最后拍摄照片。

结果：第一 部分：隐球菌脑膜炎小鼠脑组织 CD44 的 mRNA 在 12h 的 mRNA 表达水平与对照组, 48h,4d,7d 组相比较升高,有统计学意义p0.05),没有统计学意义第三部分：试验结果表 明对照组小鼠脑组织 CD44 均匀分布在脑细胞膜上实验组中隐球菌作用小鼠 6h,12h 后,小 鼠脑组织 CD44 的分布没有明显变化,作用 24h 后,隐球菌诱导脑组织 CD44 向脑组织的一侧 移行,作用 48h,72h 后,CD44 的分布发生了明显变化,在隐球菌脑膜炎脑膜侧的脑组织分布大 量的 CD44,而在脑实质侧 CD44 的分布明显减少更重要的是在病灶周围的脑组织 CD44 分 布也观察到一侧增加,另一侧分布减少结论：1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织试验组 CD44 的 mRNA 水平表达出现短暂性增高隐球菌脑膜炎小鼠试验组 CD44 蛋白表达与对照组没 有发生显著的变化2、隐球菌侵入小鼠大脑后,隐球菌诱导 CD44 向脑组织的一侧移行,向印度至诚大药房 c6j 编辑脑膜方向脑组织聚集病灶周围脑组织 CD44 也出现不均衡性分布说明了隐球菌脑膜炎 的发生与 CD44 分子有密切的关系。